Els últims avenços en biologia molecular i cel·lular no tan sols han contribuït al coneixement de la base molecular de moltes malalties, sinó que també han proporcionat una tecnologia amb potencial de manipulació de gens in vivo. La teràpia gènica sorgeix com una estratègia terapèutica basada en la transferència de material genètic per al tractament de malalties d'origen genètic o infecciós, substituint, reparant o potenciant la funció biològica dels teixits o sistemes lesionats. Els principals estudis en aquesta línia d'investigació estan dirigits al desenvolupament de vectors eficients en la transferència gènica. En els últims anys, l'ús de vectors no vírics en teràpia gènica ha anat prenent importància, ja que tot i que s'ha demostrat que els vectors vírics són eines molt eficients en la transferència de DNA, presenten limitacions associades, com ara la difícil obtenció de títols elevats de partícules víriques, la inducció de respostes immunològiques i riscs de seguretat biològica com la mutagènesi insercional i la possible reversió a vectors recombinants competents en replicació. És molt important assegurar dins del ús de sistemes no vírics, processos de transferència gènica mediada per receptor, no tan sols per dirigir el procés d'internalització cel·lular eficientment, sinó per poder mantenir l'especificitat per un tipus cel·lular diana. Les proteïnes quimèriques recombinants són candidats molt interessants en la transferència gènica no vírica. La generació d'aquests vehicles ha estat poc explorada dins la teràpia gènica, i es basa en la combinació de diverses proteïnes o dominis proteics bioactius en una sola cadena polipeptídica. Aquestes regions heteròlogues combinades, aporten capacitat d'unir molècules de DNA, el reconeixement i la internalització cel·lular i possibles funcions potenciadores de la transferència cel·lular com ara la llisi d'endosomes i el transport nuclear. Els senzills processos de producció i purificació a gran escala i la seva naturalesa modular, fan que siguin vehicles fàcilment optimitzables i adequables a noves aplicacions de teràpia gènica i amb un elevat potencial com a vectors alternatius als sistemes vírics. En aquesta Tesi Doctoral s'han desenvolupat un grup de proteïnes quimèriques prototip, basades en l'enzim b-galactosidasa d'Escherichia coli, que presenten en la seva superfície una cua de lisines com a domini d'unió a DNA i la regió de reconeixement cel·lular del virus de la febre aftosa basada en motius RGD. A més a més, l'enzim b-galactosidasa funciona com a domini de purificació del constructe resultant i permet detectar i quantificar les proteïnes quimèriques mitjançant assaigs colorimètrics senzills. La presència de forma natural en aquest enzim d'una seqüència de localització nuclear críptica permet a aquestes proteïnes dirigir eficientment la transferència de DNA en cèl·lules de mamífer. La primera construcció obtinguda va ser anomenada 249AL i es va demostrar que unia i condensava DNA eficientment i era capaç de dirigir específicament, mitjançant el reconeixement de la integrina avb3, la seva transferència en cultius cel·lulars. Després d'optimitzar el procés de transferència gènica in vitro es van realitzar aproximacions in vivo injectant complexes de proteïna-DNA intracerebralment en rates. Els resultats mostraven que la proteïna 249AL és un prototip de vector alternatiu al ús de vectors vírics en el SNC, especialment en aplicacions terapèutiques a zones lesionades en les que es produeix un increment de l'expressió dels gens de les integrines avb3. Derivats de la proteïna 249AL, com la proteïna NLSCt, demostren que mitjançant la incorporació de nous dominis com ara altres senyals de localització nuclear, com la del Antigen-T de SV40, és poden obtenir nivells d'expressió gènica més elevats. Aquests resultats conviden a aprofundir en l'aproximació modular al disseny de vectors recombinants no vírics per a teràpia gènica.
Desenvolupament de proteïnes quimèriques multifuncionals com a vectors de transferència gènica mediada per receptor
Arís Giralt, A. (Autor). 11 d’abr. 2003
Tesi d’estudis: Tesi doctoral
Tesi d’estudis: Tesi doctoral