El metanol está emergiendo como una materia prima de interés creciente para la producción de compuestos químicos de alto valor a partir de microorganismos, gracias a su origen potencialmente renovable (por ejemplo, a partir de CO₂) y a las ventajas económicas y medioambientales que ofrece. En este contexto, la levadura metilotrófica Komagataella phaffii (también conocida como Pichia pastoris) destaca como una fábrica celular prometedora para la industria química basada en metanol. K. phaffii no solo es capaz de asimilar metanol, sino que también presenta otras ventajas metabólicas e industriales, como la compartimentación de rutas sintéticas gracias a la presencia de orgánulos (peroxisomas, mitocondrias) y su tolerancia natural a condiciones ácidas, lo cual es especialmente relevante para la producción de ácidos carboxílicos. En esta tesis, K. phaffii ha sido modificado genéticamente para producir ácido 3-hidroxipropiónico (3-HP) a partir de fuentes de carbono renovables como el metanol. El 3-HP es un ácido orgánico de tres carbonos considerado un producto plataforma, ya que es precursor del ácido acrílico y otros compuestos industriales. Aunque ya se ha logrado producirlo biológicamente en diversos microorganismos, las métricas de producción siguen siendo un desafío para su aplicación industrial generalizada. La ingeniería metabólica, por tanto, desempeña un papel clave para mejorar estos parámetros. La tesis comienza con la compartimentación de la ruta metabólica del malonil-CoA en el peroxisoma, mediante la localización del gen mcr de Chloroflexus aurantiacus en este orgánulo y la aplicación de otras estrategias de ingeniería para aumentar la disponibilidad de precursores. No obstante, la producción de 3-HP fue inferior a la de las cepas con producción citosólica. La producción peroxisomal de 3-HP se reconceptualizó como un sistema biosensor para estudiar la disponibilidad de NADPH en este orgánulo. A través de este sistema se pudo identificar una estrategia prometedora para aumentar el NADPH peroxisomal: la coproducción del sistema lanzadera Idp2/Idp3 y la NADH quinasa citosólica cPos5 de Saccharomyces cerevisiae. A pesar de las prometedoras aplicaciones de la ruta peroxisomal, la producción citosólica se estableció como la mejor opción para obtener altas productividades. Además, mediante simulaciones con un modelo metabólico a escala genómica de K. phaffii, la ruta de la β-alanina fue identificada como una vía más eficiente que la del malonil-CoA para producir 3-HP a partir de metanol. Así, se implementó por primera vez esta ruta en K. phaffii mediante la expresión de los genes heterólogos panD, yhxA y ydfG. La optimización de esta cepa permitió obtener hasta 21. 4 g/L de 3-HP con un rendimiento de 0. 15 g/g y una productividad volumétrica de 0. 48 g/L·h. Esta cepa fue mejorada mediante la introducción de una variante de formiato deshidrogenasa NADP⁺-dependiente para aumentar la disponibilidad de NADPH, lo que resultó en mejoras en el consumo de metanol y en la productividad específica de 3-HP. Además, un segundo ciclo de ingeniería metabólica enfocado en incrementar precursores y la exportación de 3-HP dio lugar a la cepa con mejores rendimientos. Su cultivo en discontinuo alimentado (fed-batch) aumentó en un 42% la concentración de 3-HP y en un 22% su productividad volumétrica en comparación a la cepa de referencia. Además, los cultivos a pH 3. 5 demostraron el papel de los transportadores de ácidos monocarboxílicos en la tolerancia al 3-HP en condiciones ácidas. En conjunto, esta tesis demuestra el potencial de K. phaffii para la producción sostenible de 3-HP a partir de metanol, alcanzando la productividad volumétrica más alta reportada hasta la fecha en este contexto.
Metabolic engineering of Komagataella phaffii for renewable methanol bioconversion into 3-hydroxypropionic acid
Àvila Cabré, S. (Autor/a). 26 jun 2025
Tesis doctoral