Insights into the functional role of Cytosolic Carboxypeptidases 1 and 6: from interactomics to cell biology

Resumen

Se hipotetiza que las proteasas regulan casi todas las funciones biológicas, ya que representan un porcentaje considerable del genoma humano. Sin embargo, poco se sabe sobre las funciones biológicas de muchas de ellas. Esto es especialmente cierto en el caso de las carboxipeptidasas citosólicas, de las que se han sugerido funciones e implicaciones, pero a menudo se desconocen sus verdaderas actividades biológicas y su implicación en procesos celulares complejos. El presente trabajo de tesis doctoral trata sobre la caracterización funcional de las carboxipeptidasas citosólicas 1 y 6, dos enzimas desglutamiladoras miembros de la subfamilia M14D de metalocarboxipeptidasas que se han relacionado con procesos celulares relevantes tales como neurodegeneración y ciliopatías. Así pues, nuestra investigación se ha centrado específicamente en determinar el papel funcional de las CCPs bajo un punto de vista biomédico, tratando de surgir nuevos conocimientos sobre su implicación en la salud y la enfermedad. Con este objetivo se han realizado estudios de biología celular, generación de knock out mediante CRISPR/Cas9, obtención de imágenes de alta resolución y evaluación de la actividad enzimática. Además, se ha desarrollado y aplicado una técnica proteómica para el estudio del paisaje interactómico de estas carboxipeptidasas. Este trabajo de tesis se compone de tres capítulos interconectados en los que se caracterizan funcionalmente las carboxipeptidasas citosólicas 1 y 6. En el primer capítulo nos hemos propuesto la caracterización general de la CCP1 humana, el miembro más grande de la familia CCP, siendo el que tiene el mayor número de dominios predichos. La elucidación de los papeles funcionales específicos en cada orgánulo ha sido durante mucho tiempo un factor que ha contribuido significativamente al estudio de las CCPs. Por ello, en este capítulo nos hemos centrado en cómo las células se ven afectadas por la pérdida de actividad de CCP1. Se han determinado las consideraciones generales de CCP1 en cuanto a su papel funcional utilizando el knock out del gen, centrándonos en sus implicaciones en los procesos generales de desglutaminación, describiendo su localización subcelular y su papel funcional nuclear específico. El segundo capítulo está destinado a la identificación de los paisajes interactómicos de CCP1 y CCP6 en humanos bajo un punto de vista biomédico. Desvelar las interacciones proteína-proteína puede revelar cómo éstas están implicadas en diferentes procesos, proporcionando pistas o ayudando a determinar su implicación en enfermedades. En este capítulo se han generado los paisajes interactómicos de CCP1 y CCP6 a partir de células humanas in vitro, identificando nuevos potenciales interactores y sustratos que nos han permitido conocer su papel funcional. El trabajo proteómico realizado en este capítulo se llevó a cabo en el Grupo Bioscope (Universidade Nova de Lisboa, Portugal) dirigido por el profesor José Luis Capelo bajo la vigilancia del Dr. Hugo Santos. En el último capítulo nos propusimos caracterizar el ‘dominio N’ conservado de las carboxipeptidasas citosólicas, centrándonos en CCP6 como unidad mínima de expresión de CCP. Este dominio característico se conserva a lo largo de la línea evolutiva, estando presente en todas las CCPs identificadas, pero no en otras metalocarboxipeptidasas. Aunque se ha realizado un extenso trabajo para describir el dominio catalítico conservado, se sabe poco sobre el ‘dominio N’ y su implicación en la actividad de las CCPs. En la actualidad, la única información relativa al ‘dominio N’ se ha obtenido de Caenorhabditis elegans. En este capítulo, hemos evaluado los efectos de una mutación puntual en este dominio sobre la actividad enzimática de la CCP6 humana, a la vez que evaluamos sus implicaciones en la estabilidad de la proteína, la localización subcelular y la especificidad del sustrato. El trabajo experimental de este capítulo se realizó en colaboración con Paula Alfonso.

Fecha de lectura	10 feb 2022
Idioma original	Inglés
Supervisor	Julia Lorenzo Rivera (Director/a)