Este proyecto comenzó a partir de un hallazgo fortuito por parte del grupo del Dr. Joan Verdaguer (Universitat de Lleida) de un péptido denominado DIF-P derivado de la periferina, que pertenece a una gran familia de péptidos derivados de filamentos intermedios (FI). Estos péptidos tienen actividad pro-inflamatoria y citotóxica (a concentraciones mayores a 50 µM) y presentan una secuencia core de 9 aminoácidos altamente conservada en todos los FI. En este trabajo se ha realizado una caracterización exhaustiva de diversas actividades (hemolítica y antimicrobiana), aparte de las dos antes citadas. Para obtener una mayor penetración e internalización celular a través de las membranas biológicas, a los péptidos de estudio se les realizaron modificaciones en su extremo carboxilo-terminal, como la adición de secuencias de 8 argininas (8R), lo que incrementa sus actividades.
Adicionalmente, se han ido superando diversas dificultades, como la baja solubilidad de algunos de estos péptidos en medios salinos, que finalmente se pudo resolver mediante la conjugación con el polímero Pluronic F-127 y su derivado carboxilado, una molécula que polimeriza formando micelas (m) e incorpora a los péptidos catiónicos, solubilizándolos, sin que se observe pérdida de actividad.
A su vez, se ha descubierto que uno de los péptidos identificados, denominado K18, porque deriva del FI queratina 18, tras la adición de las colas de 8R presenta una mayor actividad hemolítica, citotóxica y antimicrobiana que el inicialmente descubierto (DIF-P), por lo que el péptido K18-8R es el que hemos utilizado mayoritariamente en nuestros experimentos.
Asimismo, se ha profundizado en la actividad pro-inflamatoria del K18-8R(m), y se ha visto que esta es óptima a concentraciones de 5 µM. También, se ha comprobado que, en células del sistema inmune innato, activa al inflamasoma NLRP3 e induce la producción de IL-1 beta, un proceso que se inhibe con inhibidores específicos de dicho inflamasoma.
Por otro lado, se han realizado estudios mecanísticos mediante ensayos de microscopía electrónica usando bacterias, y se ha observado que K18-8R(m) es capaz de producir roturas en la membrana de estas. Para corroborar dicho efecto, se han realizado ensayos de microscopía confocal o fluorimetría utilizando fluorocromos específicos como Calbryte, confirmando que este péptido provoca la salida de Ca2+ intracelular, lo que da soporte a la idea de que provoca algún tipo de disrupción en las membranas celulares, probablemente debido a formación de poros u otras estructuras.
Por último, se ha descubierto una nueva actividad del péptido como agente potenciador de la transducción (PT), una línea aplicable a estrategias de terapia génica ex vivo. Para estudiar dicha actividad, se han realizado una gran cantidad de experimentos de transducción génica utilizando vectores lentivirales pseudotipados con la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) y codificando para una proteína fluorescente (eGFP+), tanto en líneas celulares murinas y humanas, como primarias: en progenitores hematopoyéticos CD34+, células T y NK humanas. Los resultados obtenidos con el péptido K18-8R(m) a concentraciones de entre 1 y 3 µM son altamente prometedores, mejorando la transducción hasta 8 veces, dependiendo del tipo de célula diana y de las condiciones experimentales utilizadas, y con unos resultados superiores a los obtenidos utilizando el producto competidor que mejor ha funcionado (LentiBoost) que está actualmente aprobado para uso clínico.
En definitiva, se ha descubierto un nuevo PT denominado K18-8R(m) que podría mejorar la eficiencia y la especificidad de la modificación genética, reduciendo las dosis necesarias de vectores y contribuyendo a la durabilidad y al éxito para el avance de la terapia génica ex vivo y su eventual aplicación en una amplia variedad de enfermedades.
| Fecha de lectura | 5 feb 2024 |
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| Idioma original | Español |
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| Supervisor | Lluis Tort Bardolet (Director/a) & Jorge Barquinero Mañez (Director/a) |
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