Los dominios de activación están presentes en la porción N-terminal de la forma inactiva de las procarboxipeptidasas de la subfamilia de proteasas M14A, y sus funciones descritas comprenden tanto el mantenimiento de este estado inactivo como la asistencia en el plegamiento de la enzima completa. Su limitada longitud y notable estabilidad, derivada de la gran cantidad de estructura secundaria, han hecho que uno de estos dominios, el de la procarboxipeptidasa A2 humana (ADA2h) haya sido un buen modelo para el estudio del plegamiento proteico, en trabajos anteriores, y de la agregación en forma de fibras amiloides en la presente tesis. Los estudios cinéticos de dicroísmo circular de la variante salvaje y una extensa batería de mutantes puntuales revelan la secuencia correspondiente a la cadena beta-4 como la responsable de la dirección del proceso de agregación ordenada en conformación beta. Mutaciones en esta zona tienen la capacidad tanto de acelerar dramáticamente la velocidad de agregación, como de abolirla totalmente. Las correlaciones con algoritmos predictivos de agregación basados en las propiedades fisicoquímicas de la secuencia polipeptídica ponen de manifiesto la relevancia principal de la estructura primaria en el gobierno del proceso. La cinética de agregación por dicroísmo circular muestra una naturaleza dual, con una segunda etapa prácticamente independiente de concentración proteica, indicando una etapa tardía de reorganización conformacional. Estudios cinéticos complementarios por espectroscopia de infrarrojo muestran igualmente una reorganización molecular y señalan que la conformación agregada en beta presente en la fibra amiloide parece originarse primeramente a partir de las hélices alfa parcialmente desplegadas. El estudio de mutantes con diferente propensión de agregación y estabilidad ha demostrado que las mutaciones producen cambios en la vía de agregación, pero que finalmente convergen en el mismo punto de fibrilación. Una posible función alternativa para uno de estos dominios, las cuales tienen una extraordinaria complejidad en comparación con otras secuencias inhibidoras en cis, ha sido buscada mediante herramientas bioinformáticas. Cierta similitud secuencial y estructural parece haber sido encontrada entre el dominio de activación de la procarboxipeptidasa A4 humana (ADA4h) y un dominio de unión a RNA (RRM), sugiriendo una posible función ancestral para el primero, aunque no todos los residuos clave para la interacción son presentes en ADA4h. La hipótesis ha sido comprobada experimentalmente mediante un gel de retardo, observándose una unión a RNA débil e inespecífica para el RNA ensayado, de acuerdo con lo que había sido predicho bioinformáticamente. Este hecho no excluiría una unión fisiológica y específica con otra molécula de RNA diferente a la ensayada.
Caracterització cinètica de la formació de fibres amiloides i cerca de funcions remotes de dominis d'activació de procarboxipeptidases humanes
Cerdà Costa, N. (Autor/a). 16 dic 2008
Tesis doctoral