Biodistribución de bacteriófagos tras terapia fágica oral y emergencia de resistencia bacteriana a los fagos.

Tesis doctoral

Resumen

La aplicación terapéutica de bacteriófagos líticos como alternativa a los antimicrobianos tradicionales ha resurgido en los últimos años. Sin embargo, existen algunos aspectos asociados a la terapia fágica que necesitan estudiarse con más profundidad para permitir su definitiva implementación. El presente trabajo se centra en el estudio de dos aspectos de especial relevancia: i) la emergencia de la resistencia a los bacteriófagos en diferentes condiciones de aplicación y ii) la biodistribución y transcitosis de bacteriófagos encapsulados en liposomas tras su administración por vía oral en un modelo murino. Para el estudio de la emergencia de la resistencia bacteriana a bacteriófagos se utilizó el modelo de Salmonella/cóctel de bacteriófagos integrado por UAB_Phi20, UAB_Phi78 y UAB_Phi87, cuyos receptores se localizaban en el LPS. Se evidenció que la emergencia de resistencia difería en función del ámbito de aplicación. Así, el 92 % de los aislados de cultivos in vitro de S. Typhimurium infectados con el cóctel de bacteriófagos fueron resistentes a los 3 fagos, siendo la causa probable de la resistencia la pérdida de la proteína RfaJ, implicada en la síntesis del LPS. Análogamente, en lonchas de jamón cocido contaminadas con S. Typhimurium y tratadas con el cóctel fágico, el 1,4 % de los aislados fueron resistentes a los tres fagos, mostrando también una mutación en el gen rfaJ; mientras que el 1,8 % sólo presentó resistencia a los fagos UAB_Phi20 y UAB_Phi78, debido a cambios en el gen rfc, el cual codifica la polimerasa del antígeno O. Finalmente, en los estudios de terapia fágica en el modelo de pollo de engorde, no se encontró ningún clon resistente al fago UAB_Phi78 aislado de animales contaminados con S. Typhimurium y tratados con el cóctel. Sin embargo, el 8,5 % de los aislados del grupo control fueron resistentes a los tres fagos, no habiéndose podido determinar la causa de dicha resistencia. Por otro lado, el 1,3 % y el 3,3 % de los clones de los animales del grupo control y tratamiento, respectivamente, mostraron resistencia al bacteriófago UAB_Phi78, el cual ejerció un efecto bactericida, pero no bacteriolítico y sin producción de progenie fágica y resistencia asociada a UAB_Phi87. Aunque la causa de dicha resistencia no se ha podido identificar, todo sugiere la implicación de un mecanismo basado en una infección abortiva. En conclusión, este estudio revela que tanto la frecuencia de la emergencia de resistencia como los mecanismos causantes de la misma son diferentes in vitro, en alimentos e in vivo. Además, demuestra la necesidad de abordar los estudios de resistencia de un modo más amplio y de utilizar cócteles que contengan bacteriófagos que reconozcan diferentes receptores para disminuir el desarrollo de resistencias. En el estudio de biodistribución, se administró oralmente el fago UAB_Phi20 encapsulado en liposomas y marcado con el fluorocromo VTS-750 a ratones y visualizándolos mediante el sistema IVIS Spectrum. Esta metodología combinada con métodos de cultivo ex vivo, demostró que la encapsulación daba lugar a un aumento significativo de fagos encapsulados en el estómago 6 h después de su administración. Igualmente, los bacteriófagos encapsulados en liposomas también se encontraron en el bazo, hígado y músculo. Por otro lado, la aplicación de CLSM en cultivos in vitro de células intestinales humanas (Caco-2/HT29/Raji-B) reveló que los liposomas se adhieren a las membranas de dichas células pudiendo permanecer en su interior. En cambio, los bacteriófagos no encapsulados son capaces de translocar la barrera intestinal. Así, la prolongada persistencia de los fagos encapsulados en el estómago y su adherencia a la membrana intestinal podría explicar la mayor eficacia en el tiempo de la terapia fágica oral empleando bacteriófagos encapsulados en liposomas.

Fecha de lectura20 nov 2019
Idioma originalEspañol
SupervisorMontserrat Llagostera Casas (Director/a), Maria Pilar Cortes Garmendia (Director/a) & Maria Pilar Cortes Garmendia (Tutor/a)

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