Bacteriophage detection and quantification in transparent and turbid samples

Resumen

La mayoría de las técnicas de detección y cuantificación de bacteriófagos se han desarrollado para aplicaciones en entornos industriales y de salud pública, y durante muchos años los métodos convencionales como la doble capa de agar y la microscopía electrónica han sido la única opción disponible para su detección y cuantificación. Estos métodos son costosos en tiempo y en mano de obra o requieren equipos caros, respectivamente. La situación ha cambiado con la introducción de tecnologías que aportan nuevas soluciones y alternativas a los métodos convencionales. Para construir una herramienta eficaz, los métodos de detección de fagos deben tener en consideración varios factores: 1) tipo de fago; 2) nivel de sensibilidad requerido; 3) disponibilidad de huéspedes cultivables; 4) posible interferencia de la matriz de la muestra; 5) disponibilidad de equipos sofisticados y/o personal altamente calificado y, condicionando la mayor parte de los anteriores, 6) tipo de aplicación (terapia fágica, estudios de biocontrol, industria de fermentación de alimentos o control ambiental). El trabajo desarrollado en esta tesis explora la posibilidad de detectar y cuantificar bacteriófagos específicos mediante el análisis del comportamiento dinámico del sistema fago-huésped. El conjunto de datos obtenido se ha publicado y puesto a disposición de la comunidad, ya que constituye probablemente el primer estudio detallado sobre la dependencia de la concentración de fago-huésped que se ha publicado a partir del descubrimiento de bacteriófagos en la década de 1920. Todos estos elementos se pueden utilizar como base para el desarrollo de métodos específicos adaptados a cualquiera de las áreas mencionadas anteriormente. En la primera fase, hemos seguido los cambios de densidad óptica (DO) durante la lisis de cultivo inducida por fagos en medios transparentes para evaluar la cinética del huésped-fago en 90 combinaciones diferentes de concentraciones de bacterias/fagos. En una segunda fase se han empleado las propiedades fluorescentes del indicador redox resazurina para superar los problemas observados cuando se intentan realizar mediciones cinéticas de densidad óptica en medios de alta turbidez. Gracias a las propiedades fluorescentes de la resazurina, se ha evaluado la cinética fago-huésped de 186 combinaciones diferentes de concentraciones de bacterias/fagos en medios turbios sintéticos, así como en una matriz de alta complejidad como la leche. Tanto los enfoques basados en DO como en fluorescencia son complementarios y tienen un límite de detección y un tiempo de detección similares (50 ufp/ml en 3,5 h). El ensayo basado en DO es cuantitativo. El ensayo fluorescente basado en resazurina es semicuantitativo pero más rápido, detectando números altos de fagos en menos de 60 min. El principio de funcionamiento de ambos ensayos es muy flexible y se puede ajustar fácilmente a cualquier aplicación específica eligiendo la combinación correcta de fago-huésped, ya sea en muestras limpias o turbias. Finalmente, la tecnología utilizada es relativamente simple y muy adecuada para su posterior miniaturización, automatización y aplicación a análisis de alto rendimiento.

Fecha de lectura	5 oct 2021
Idioma original	Inglés
Supervisor	Jordi Mas Gordi (Tutor/a)