El mal plegamiento y la agregación amiloide de la transtiretina (TTR) se asocian a un grupo de trastornos de pronóstico fatal conocidos como amiloidosis por TTR (ATTR). Estas enfermedades son mayoritariamente hereditarias y están causadas por mutaciones que desestabilizan el estado nativo de la TTR. Hay que indicar que la deposición de la variante natural de la proteína parece ser una causa frecuente de insuficiencia cardíaca en las personas mayores. Ciertas moléculas pequeñas que se unen a la TTR pueden actuar como estabilizadores cinéticos, impidiendo la disociación del tetrámero y, por tanto, la agregación. En este contexto, nuestro grupo reposicionó tolcapone, una molécula aprobada por la FDA para la enfermedad de Parkinson, como un potente inhibidor de la agregación de TTR. Además, al ser capaz de atravesar la barrera hematoencefálica podría suponer una opción para la amiloidosis leptomeníngea, intratable a fecha de hoy. En la presente tesis, demostramos que tolcapone se une e inhibe la agregación de las variantes de TTR asociadas con la amiloidosis leptomeníngea, lo que sugiere que puede convertirse en el primer fármaco de amplio espectro para tratar todas las manifestaciones de la enfermedad. Las estructuras de los complejos cristalográficos (TTR:tolcapone) revelaron la posibilidad de mejorar su potencia estableciendo contactos adicionales con la proteína. Combinando el diseño racional y las simulaciones de dinámica molecular diseñamos M-23, una molécula que presenta una de las mayores afinidades por la TTR descritas hasta la fecha. La estructura cristalina confirmó que, como se pretendía, M-23 forma nuevos y fuertes contactos con la TTR, lo que conduce a una mayor estabilización del tetrámero tanto in vitro como en suero en relación con tolcapone. Estos resultados nos animaron a seguir avanzando M-23 como fármaco para la ATTR, aunque su deficiente perfil farmacocinético podría comprometer su uso terapéutico. En este contexto, desarrollamos PITB, un derivado de M-23 que mantiene las interacciones que establece con TTR al tiempo que mejora su farmacocinética. La caracterización estructural y biofísica de la interacción de PITB con TTR reveló que se une con alta afinidad tanto a la proteína de tipo salvaje como a las dos variantes de TTR más significativas clínicamente, las estabiliza e inhibe su agregación. Y lo que es más importante, el PITB ejerce un mayor efecto estabilizador del tetrámero en plasma de pacientes que tolcapone, lo que unido a su destacable farmacocinética hacen de PITB un candidato muy prometedor para tratar la ATTR y a un coste asequible para todos los pacientes. Aunque se han obtenido muchos conocimientos en estos estudios a través de estructuras tridimensionales, estos no arrojan luz sobre la dinámica de las alteraciones conformacionales implicadas en la amiloidogenicidad de las variantes de TTR ni para evaluar el efecto de ligandos estabilizantes. Con el objetivo de cubrir esta necesidad, en el presente trabajo explotamos el potencial de dos técnicas analíticas de huella peptídica basadas en la espectrometría de masas como son el intercambio de deuterio por hidrógeno (HDX) y la oxidación fotoquímica rápida de proteínas (FPOP). Los datos obtenidos nos han proporcionado información relevante tanto sobre el efecto de las mutaciones patogénicas de la TTR como de los agentes estabilizantes analizados. Por todo ello, estas técnicas nos permiten establecer una alternativa muy prometedora y que no ha sido explorada previamente para el cribado personalizado de estabilizadores cinéticos de TTR dirigidos a variantes específicas. En conjunto, los resultados obtenidos en esta tesis proporcionan una comprensión significativa de los determinantes estructurales de la estabilización cinética de TTR, y apoyan el desarrollo de los estabilizadores cinéticos como fármacos prometedores para el tratamiento de la ATTR.
Advancing in the treatment of transthyretin amyloidosis : Utilizing structure-driven approaches to develop kinetic stabilizers
Garcia de Carvalho Pinheiro, F. (Autor/a). 18 jul 2023
Tesis doctoral