PROMOTORES SINTETICOS PARA LA EXPRESION DE PROTEINAS RECOMBINANTES INDUCIDA POR ESTRES ALCALINO EN S. CEREVISIAE Y P. PASTORIS: DISEÑO, CONSTRUCCION Y VERIFICACION

Detalles del proyecto

Descripción

Las levaduras, principalmente S. cerevisiae y Komagataella phaffii (Pichia pastoris), se han considerado una excelente opción para la
expresión heteróloga de proteínas recombinantes de interés industrial, ya que retienen las ventajas de la producción microbiana, pueden ser modificadas genéticamente de manera sencilla y ofrecen muchas de las características de eucariotas complejos. Sin embargo, la expresión en levaduras a escala industrial todavía presenta importantes limitaciones, específicamente en lo que afecta a la elección de promotores transcripcionales regulables. Así, los habituales en S. cerevisiae (GAL1, MET25, CUP1, etc.) son adecuados a escala de laboratorio, pero no para la producción industrial a gran escala, ya que implican manipulaciones complejas (p. ej., cambios en la fuente de carbono), requieren cepas auxotróficas o emplean inductores tóxicos. Análogamente, el sistema más utilizado en P. pastoris (promotor AOX1), requiere el cultivo de la levadura en metanol como fuente de C, una sustancia inflamable y peligrosa. Por ello, se están intensificando en los últimos años los esfuerzos para encontrar plataformas alternativas basadas en promotores inducibles más convenientes. Nuestras investigaciones en el contexto del proyecto PID2020-113319RB-I00 han confirmado la hipótesis de partida, basada en mostrar que el uso de elementos transcripcionales regulados por pH alcalino podía dar lugar a nuevas plataformas de expresión controladas por pH en S. cerevisiae. Mediante estrategias de combinatoria random de módulos sintéticos se han creado
múltiples promotores que han mostrado su capacidad a escala de laboratorio y que están listos para ser utilizados en la expresión de proteínas de interés industria. Por otra parte, se han definido en P. pastoris el perfil transcripcional de respuesta a pH alcalino, identificándose varios promotores de interés. Tres de ellos (TSA1, HSP12 y PHO89) han sido empleados con éxito a escala de laboratorio para la expresión de una fitasa, consiguiéndose una cepa
evolucionada basada en PHO89 que produce niveles superiores a los de la
cepa AOX1 comercial. Estos resultados apoyan firmemente la idea de que el concepto de promotores híbridos regulables por pH alcalino es exportable a P. pastoris y que las plataformas de expresión regulables por pH alcalino, por su simplicidad y economía, pueden ser una excelente alternativa a los sistemas usados actualmente. La presente propuesta es una expansión lógica de las investigaciones en marcha, enfatizando el desarrollo de estos sistemas en P.
pastoris. Para ello, proponemos 1) profundizar en el conocimiento de la respuesta transcripcional y traduccional de P. pastoris a la alcalinización del medio, mediante una combinación de RNA-Seq y Ribo-Seq en cepas silvestres y mutantes en diversos elementos predecibles de señalización (Crz1, Pho4, Rim101), identificando de esta manera los reguladores idóneos. 2) Con esta información, crear promotores híbridos en P. pastoris y verificar su funcionalidad, y 3) mejorar las plataformas de expresión disponibles en la actualidad basadas en promotores naturales completos. Respecto a S. cerevisiae, nos proponemos optimizar nuestros vectores prototipo actuales para la expresión de proteínas de interés industrial. Finalmente, las plataformas de Pichia y S. cerevisiae generadas a nivel de laboratorio más prometedoras serán llevadas a escala de biorreactor, para optimizar las condiciones de expresión en un entorno pre-industrial.
EstadoActivo
Fecha de inicio/Fecha fin1/09/2431/12/27