Enginyeria d'interaccions moleculars intracèl·lulars; aplicació al disseny de biosensors i al control de la desagregació proteïca

El proyecto propuesto tiene como objetivo general el análisis funcional y mecanístico de 2 tipos de interacciones intermoleculares intracelulares: aquellas en las que intervinene ligandos recombinantes que resultan en cambios conformacionales con impacto en la actividad enzimática, y aquellas entre proteínas mal plegadas y chaperonas que conducen a su depósito como agregados o cuerpos de inclusión. En este contexto, hay cuatro objetivos parciales claramente definidos (2 en cada área): 1. Mejorar la funcionalidad y robustez de sensores enzimàticos basados en el enzima \beta-galactosidasa (portador de péptidos antigénicos foráneos) a través de la identificación de nuevos sitios (y/o combinaciones de sitios) de inserción peptídica en el enzima, el incremento de la relación señal-respuesta mediante la optimización de las condiciones del ensayo, y la ingeniería del enzima para mejorar su sensibilidad. Se pretende sentar bases teórico-prácticas para un mejor diseño racional de biosensores aplicados al diagnóstico de enfermedades infecciosas, la detección de anticuerpos y de antígenos y la señalización de ligandos específicos, que permitan mejorar el proceso de detección para su eventual automatización en un ensayo homogéneo. 2. Evaluar la funcionalidad de estos sensores en condiciones intracelulares, para construir sistemas de identificación y selección positiva de ligandos específicos de entre librerías de anticuerpos recombinantes. Se pretende conseguir un sistema intracelular basado en el enzima \beta-galactosidasa que resulte en un incremento de actividad del enzima como respuesta a la presencia de anticuerpos específicos. A su vez, en un fondo genético adecuado (LacZ-) y un medio de cultivo apropiado (lactosa como fuente de carbono), optimizar el crecimiento diferencial de los clones bacterianos positivos.3. Llevar a cabo un análisis proteómico de la formación de cuerpos de inclusión..4 Determinar los mecanismos celulares que intervienen en la solubización