Aplicació del disseny de proteïnes a l'estudi de les funcions biològiques, plegament i mecanisme de catàlisi de les ribonucleasses

Las enzimas que constituyen la superfamilia de las ribonucleasas disfrutan de unas características que las convierten en candidatos idóneos para el estudio de mecanismos relacionados con el plegamiento proteico y con la catálisis enzimática. Además de ello, algunos miembros de esta superfamilia muestran una actividad biológica que es muy interesante para su posible utilización farmacológica. En este proyecto se intentará profundizar, mediante técnicas de mutagénesis dirigida, en el conocimiento de los siguientes aspectos: 1) evaluación del papel jugado por diversos aminoácidos en la catálisis y especificidad de la reacción enzimática. En concreto la aparición de un nuevo centro catalítico por modificación de los aminoácidos constituyentes del "subsite" p\sub 2\nosub que serán substituidos por histidina. La caracterización de este nuevo centro implica la realización de un control en el que se supriman las histidinas del centro catalítico original de la enzima nativa. Se definirán también las correlaciones con el cambio de especifidad (transformación de actividad endonucleásica en exonucleásica) cuando se utilizan polinucleótidos como sustratos. 2) Estudios de la zona de nucleación del extremo C-terminal que permite el plegamiento de la ribonucleasa A a su forma nativa; en especial se valorará la influencia del grado de hidrofobicidad de residuos específicos. Se comprará el proceso con el de la ribonucleasa humana la cual contiene tres prolinas adicionales. Debido a que la presencia de estos aminoácidos da lugar a isomería cis-trans y a que la transformación de un isómero en el otro es un proceso lento la modificación de estas prolinas adicionales puede proporcionar mucha información sobre los pasos limitantes del plegamiento. 3) Se intentará dilucidar qué partes de la molécula ECP (proteína catiónica de eosinófilos), que presenta al mismo tiempo actividades citotóxicas y ribonucleásicas, son responsables de ambas actividades. 4)Finalmente, se estudiará la