Unveiling Nanomedicine using Correlative Super-Resolution and Electron Microscopy

Resum

Els tractaments actuals contra el càncer més enllà de la cirurgia inclouen teràpies que tenen un èxit limitat. Això és degut a efectes secundaris greus, que condueixen a una qualitat de vida reduïda i una baixa efectivitat. L’administració de quimioteràpia mitjançant nanotransportadors promet augmentar la selectivitat d’aquests medicaments. Els nanomaterials tenen propietats fisicoquímiques específiques i úniques que tenen un impacte crucial en el seu comportament biològic. Per tant, les propietats i les dianes biològiques s’han d’estudiar. Encara que l’arsenal de nanomaterials complexos està en constant maduració, les eines utilitzades per caracteritzar amb precisió aquestes entitats continuen sent similars a les que s’utilitzen per als fàrmacs de baix pes molecular. Éls nanomaterials tenen propietats fisicoquímiques que varien molt en comparació dels fàrmacs clàssics. Això significa que requereixen una caracterització més complexa, particularment a la nanoescala i al nivell d’una sola partícula. Actualment, hi ha una manca de tècniques adequades que estiguin optimitzades per avaluar les propietats fisicoquímiques i les dianes biològiques dels nanomaterials, que és una de les principals causes de la seva mala translació a la clínica. En aquesta tesi, proposem el desenvolupament, l’optimització i l’aplicació de tècniques d’imatge avançades com ara la microscòpia de super-resolució (SRM), la microscòpia electrònica de transmissió (TEM) i la microscòpia correlativa òptica i electrònica (CLEM) per caracteritzar i millorar la nostra comprensió dels nanotransportadors. El Capítol 1 demostra l’aplicació de DNA-PAINT i qPAINT a la quantificació de la funcionalització dels lligands de superfície i l’heterogeneïtat a les propietats dels nanomaterials. Així, formulem manualment diverses formulacions de nanopartícules (NPs) PLGA-PEG funcionalitzades amb oligonucleòtids com a lligands model i quantifiquem i comparem el nombre de lligands accessibles a cada formulació. Usant informació obtinguda partícula a partícula i molècula a molècula, DNA-PAINT va permetre l’estudi de l’heterogeneïtat en la funcionalització dels lligands. Els resultats ens van portar a redissenyar i reformular les PLGA-PEG NPs modificant l’arquitectura del PEG en superfície per exposar més lligands funcionals. El Capítol 2 segueix el desenvolupament d’una modalitat de CLEM per a estudiar la interacció entre diferents propietats fisicoquímiques en NPs de PLGA-PEG, com el nombre de lligands i la mida de la NP. Correlacionem la capacitat de quantificació de lligands de DNA-PAINT, amb l’excel·lent resolució de TEM per visualitzar la morfologia de les NPs. Això es va fer en el mateix camp de visió i vam extreure així la informació partícula a partícula. Vam identificar subpoblacions de NPs amb diferents números de lligands, que conferiran diferents comportaments biològics. Vam demostrar que, a diferència del nostre protocol correlatiu, la caracterització dels dos mètodes per separat pot limitar la informació. El Capítol 3 presenta la selecció racional i optimització d’un protocol dSTORM-TEM CLEM per al trànsit intracel·lular de PLGA-PEG NP. El protocol optimitzat ens va permetre visualitzar directament les NP fluorescents a dSTORM, i posicionar-les amb gran resolució a la ultraestructura cel·lular que ofereix TEM. Amb aquesta informació, quantifiquem la distribució de NP en diferents compartiments endo-lisosomals en diferents temps, obtenint una millor comprensió de trànsit intracel·lular. Finalment, quantifiquem el canvi en la distribució intracel·lular de les NP després de la incubació amb l’agent lisomotrópic cloroquina, fet que demostra que promou l’escapament dels endosomes. El Capítol 4 és l’aplicació del protocol dSTORM-TEM optimitzat per estudiar el comportament intracel·lular dels complexos polimèrics de pBAE. Usant dSTORM amb dos colors, vam poder localitzar i quantificar les molècules transportadores (polímers de pBAE) i el seu cargo (pDNA). D’altra banda, usant TEM podem localitzar els complexos amb precisió dins del medi intracel·lular. Comparem la capacitat d’escapar dels endosomes entre dos complexos polimèrics diferents. Per acabar, vam poder suggerir una diferència en els mecanismes d’internalització cel·lular entre les dues formulacions.

Data del Ajut	30 de juny 2022
Idioma original	Anglès
Supervisor	Schwartz Navarro, Simon (Tutor/a), Albertazzi , Lorenzo (Director/a) & Pujals Riatos, Silvia (Director/a)