Telomere deprotection and the maintenance of genome integrity: discrepancy between telomere shortening and shelterin dysfunction

Resum

Els telòmers són estructures nucleoprotèiques que segellen l’extrem cromosòmic i el protegeixen de la reparació il·legítima mitjançant la formació d’un llaç telomèric anomenat t-loop que està modulat per la proteïna TRF2. En les últimes dècades, s’ha demostrat que la disfunció telomèrica és un mecanisme capaç d’originar inestabilitat cromosòmica (CIN) en cèl·lules humanes i de ratolí i promoure la tumorigènesis en models murins._x000D_ L’objectiu d’aquesta tesi és immortalitzar cèl·lules telomèricament inestables i avaluar el seu potencial tumorigènic mitjançant la desprotecció telomèrica a través de l’escurçament telomèric o de la disfunció de la proteïna TRF2. En el Treball I, cèl·lules epitelials mamàries humanes deficients per p16INK4a (vHMECs) i deficients o no per p53 (p53+/+) foren cariotipades a diferents temps de doblatge per avaluar la presència d’anomalies cromosòmiques i l’evolució del cariotip. En l’absència de la telomerasa, els telòmers s’escurçaren de forma progressiva fins esdevenir desprotegits, i la subseqüent reparació il·legítma dels extrems afavorí l’entrada en cicles de ruptura-fusió-pont (BFB) i disparà la CIN. Tanmateix, les cèl·lules inestables finalment moren independentment de la funcionalitat de p53. Per contra, la sobreexpressió d’hTERT en les cèl·lules vHMEC-p53+/+ afavoreix la proliferació indefinida amb un cariotip gairebé estable, mentre que la immortalització de les cèl·lules vHMEC-shp53 amb signes de CIN és permissiva amb la proliferació cel·lular i l’evolució del cariotip._x000D_ _x000D_ Al Treball II i al Treball III, la desprotecció telomèrica aguda va ser induïda mitjançant l’expressió transitòria d’un dominant negatiu de TRF2 (TRF2BM). El dany telomèric agut fou avaluat en la línia cel·lular epitelial mamària MCF-10A (Treball II) i en cèl·lules epitelials mamàries (HMECs) immortalitzades derivades de pacients sanes (Treball III). Al Treball II, la desprotecció telomèrica mitjançant TRF2BM generà un increment de TIFs, fusions telomèriques i ponts anafàsics. Els ponts anafàsics es consideren els inductors dels cicles (BFB) i de la posterior reorganització cariotípica. No obstant, no s’observaren reorganitzacions cromosòmiques derivades dels cicles BFB després de l’expressió transitòria del TRF2BM, independentment de la funcionalitat de les proteïnes p53 i pRb. Després de successius cicles de desprotecció telomèrica, s’observà un increment en el nombre de cèl·lules diploides, tot suggerint que l’excessiu dany telomèric evitaria la proliferació d’aquelles cèl·lules que podrien esdevenir altament reorganitzades. Al Treball III s’expressà TRF2BM en HMECs immortalitzades mitjançant hTERT i l’antigen SV40LT (HMEC-TO). L’expressió transitòria del TRF2BM induí l’increment de ponts anafàsics, però les cèl·lules tampoc presentaren reorganitzacions pròpies dels cicles BFB en marxa. A diferència del Treball II, les cèl·lules poliploides incrementaren arrel del procés d’immortalització. Independentment de la causa d’aquest increment en les cèl·lules poliploides, les cèl·lules exposades als cicles d’expressió de TRF2BM no presentaven un fenotip associat a la disfunció telomèrica, ni tampoc un potencial tumorigènic, tot suggerint que l’expressió del mutant TRF2BM provoca un efecte deleteri sobre la viabilitat cel·lular i l’inici de la CIN._x000D_ _x000D_ En resum, la present tesi evidencia que el grau de dany telomèric és una eina de doble fil en el manteniment de la integritat genòmica. Per una banda, l’escurçament telomèric indueix un dany cel·lular progressiu i lleu, compatible amb la viabilitat cel·lular. Quan el dany telomèric assoleix un cert llindar, la cèl·lula activa mecanismes dependents i independents de p53 que indueixen la seva mort. Pel contrari, la disfunció de TRF2 afecta a un nombre molt elevat de telòmers i indueix una exagerada resposta cel·lular que la fa incompatible amb la viabilitat cel·lular i la reorganització del cariotip. Aquesta tesi demostra que la desprotecció simultània d’un nombre elevat de telòmers pot ser una eina útil per generar un dany al DNA molt elevat i mantenir la integritat genòmica.

Data del Ajut	4 de febr. 2019
Idioma original	Anglès
Supervisor	Laura Tusell Padros (Director/a)