En aquest treball s'han estudiat diferents sistemes estratificats, un de bentònic (tapissos microbians del delta de l'Ebre) i tres de planctònics (estanyols d'en Cisó i el Vilar i el llac Gran d'Estanya), mitjançant l'ús combinat de tècniques de microbiologia moleculars (RFLP, DGGE i FISH) i clàssiques (microscòpia òptica i anàlisi dels paràmetres fisicoquímics). L'aplicació de les tècniques moleculars ens ha permès demostrar que genèticament hi ha variacions, tant en fondària com al llarg del temps, en l'estructura i la dinàmica de les poblacions microbianes que habiten en aquests ecosistemes. Les tècniques clàssiques aplicades, en canvi, s'han emprat per a relacionar aquests canvis genètics amb les fluctuacions ambientals i biològiques. Inicialment, es va determinar la distribució en fondària i al llarg del temps de diferents paràmetres fisicoquímics que s'estableixen en els sistemes estratificats estudiats. A continuació, es van caracteritzar mitjançant microscòpia òptica el gruix, el color i les poblacions dominants presents en cadascuna de les laminacions dels tapissos microbians. De la mateixa forma, al llac Gran d'Estanya es van descriure les poblacions dominants presents en les diferents fondàries. L'anàlisi preliminar de tots els sistemes estratificats estudiats ens va permetre demostrar que, en general, les condicions i les poblacions dominants es mantenien força semblants a les descrites en treballs anteriors. Posteriorment, es dugué a terme l'anàlisi molecular amb tècniques de caracterització genètica (RFLP i DGGE) i d'hibridació in situ (FISH), basades en l'estudi dels 16S ADNr i 16S ARNr, respectivament. En cadascuna de les laminacions i fondàries dels diferents sistemes estratificats estudiats, els gens dels 16S ARNr foren amplificats per PCR amb encebadors universals per als dominis Bacteria i Archaea. El primer dels dominis es va trobar àmpliament distribuït en tots els sistemes estratificats i es va detectar al llarg de totes les laminacions i fondàries estudiades. En canvi, el domini Archaea presentava una distribució més heterogènia i es detectava en el sediment negre dels tapissos microbians i en les fondàries dels llacs on les concentracions de sulfur d'hidrogen eren més elevades. A l'estanyol del Vilar i al llac Gran d'Estanya, a més, es van detectar membres d'aquest darrer domini en algunes fondàries de la part oxigènica. Seguidament, els productes de la PCR van ser digerits amb enzims de restricció d'alta freqüència de tall (AluI, HinfI i RsaI) i es van analitzar els patrons dels 16S ADNr-RFLP bacterians obtinguts per electroforesi en cadascun dels sistemes estratificats. Aplicant els mètodes UPGMA i MDS, la similitud entre els patrons dels 16S ADNr-RFLP ens va permetre obtenir les corresponents matrius a partir de les quals es va poder concloure que les mostres presentaven una distribució estacional en tots els sistemes estudiats, exceptuant les del llac Gran d'Estanya. Malgrat aquest fet, les diferències estacionals quant al nombre de fragments de restricció només foren estadísticament significatives als tapissos microbians del delta de l'Ebre i a l'estanyol del Vilar. En tots els sistemes estratificats estudiats, les diferents submostres es van subagrupar, majoritàriament, en funció de dos paràmetres abiòtics, la llum i la presència d'oxigen. Una vegada visualitzats els patrons de restricció, s'observà que els obtinguts en el període de barreja al llac Gran d'Estanya mostraven una gran similitud amb els de la part més fonda del llac en el període d'estratificació. Per a corroborar aquesta observació, es va decidir aplicar al llac Gran d'Estanya un altra tècnica de caracterització genètica: la DGGE. Els patrons resultants dels 16S ADNr-DGGE, igual que els dels 16S ADNr-RFLP, van confirmar aquesta similitud. L'aplicació d'aquesta tècnica, a més a més, ens va permetre obtenir una visió general de la diversitat bacteriana per escissió i seqüenciació de les bandes dominants. Les seqüències obtingudes foren afiliades dintre dels quatre fílums del domini Bacteria: Cianobacteria, Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB), Proteobacteria (classes a i b) i Chlorobi. L'anàlisi de les seqüències obtingudes demostrà que les diferències espacials eren degudes a variacions de les poblacions bacterianes dominants (Cianobacteria, Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides i a-Proteobacteria) detectades en cadascuna de les fondàries del llac. En canvi, les diferències estacionals existents eren degudes, principalment, a l'aparició del grup b-Proteobacteria a l'hivern i a l'aparició de Chlorobi a l'estiu. Al llac Gran d'Estanya, a més de la informació qualitativa obtinguda amb les tècniques de caracterització genètica, per primera vegada s'ha estudiat quantitativament com es distribueixen en fondària i al llarg del temps les poblacions d'organismes actius mitjançant l'aplicació de la hibridació in situ. Tot i estar limitada per la presència de partícules de naturalesa inorgànica i per una elevada proporció d'organismes fototròfics autofluorescents, la informació obtinguda amb aquesta tècnica ens va permetre descriure canvis espaciotemporals de les poblacions bacterianes (sondes Eub338, Non338, Srb338, Dsv698, Dss658, Alf968, Bet42a i Gam42a) i d'Archaeas (sonda Arch915) analitzades. Els percentatges d'hibridació obtinguts pel domini Bacteria foren superiors en la part superficial del llac en el període d'estratificació, mentre que el domini Archaea fou més abundant en la part més fonda del llac del mateix període. Pertanyents al domini Bacteria, i detectats en ambdós períodes de l'any estudiats, la distribució dels percentatges d'hibridació dels bacteris sulfatoreductors i dels a-, b- i g-Proteobacteria varià en fondària. La comparació entre els percentatges d'hibridació obtinguts i els patrons dels 16S ADNr-RFLP determinà que, en alguns casos, tot i haver-hi diferències quantitatives, aquestes no es reflectien qualitativament. Finalment, per a esbrinar com podien quedar afectats els RFLP obtinguts en mostres naturals per dos factors que influencien l'eficiència de la PCR, la presència de mals aparellaments entre els encebadors i les seqüències diana d'aquests i el diferent nombre d'operons d'ADNr, es va desenvolupar una aproximació teoricopràctica. Amb aquest propòsit, es van seleccionar quatre soques bacterianes de les quals es coneixien ambdós paràmetres i es van analitzar els RFLP de diferents mescles. Els resultats obtinguts van demostrar que tots dos factors contribuïen significativament a l'hora d'obtenir els perfils genètics. D'aquesta forma, un nombre alt d'operons d'ADNr permetia una eficiència de detecció més gran, i un grau d'homologia més baix entre els encebadors i les seves seqüències diana implicava una disminució d'aquesta.
| Data del Ajut | 3 de des. 2003 |
|---|
| Idioma original | No s'ha definit/desconegut |
|---|
| Supervisor | Nuria Gaju Ricart (Director/a) |
|---|