En aquesta tesi doctoral es presenta el desenvolupament de noves eines per al diagnòstic precoç i el seguiment de malalties no transmissibles. Tot i que existeixen metodologies d'alt rendiment disponibles al mercat per aquest objectiu, l'alt cost i la baixa disponibilitat en entorns de baixos recursos dificulten la seva implementació en centres d'atenció primària dels països en desenvolupament. Per tant, el disseny de nous mètodes segueix sent essencial per reduir la incidència d'aquestes malalties. A més del desenvolupament de nous dispositius de diagnòstic més senzills i menys costosos, la cerca de nous biomarcadors en biòpsies líquides és molt rellevant. Entre els diferents tipus de biomarcadors, l'estudi de les vesícules secretades per les cèl·lules pot proporcionar informació rellevant sobre processos fisiològics i patològics dels teixits. Els exosomes són vesícules extracel·lulars de mida nanomètrica que s'estan estudiant intensament com a potencials biomarcadors de diagnòstic en moltes malalties, especialment, en biòpsies líquides per al càncer degut al seu alliberament augmentat per les cèl·lules canceroses amb la seva empremta molecular alterada. Aquest treball s'enfoca a l'estudi de les proves de diagnòstic ràpid (RDT, en anglès rapid diagnostic test) per a exosomes com a biomarcadors d'interès clínic. En concret, se centra en la millora dels paràmetres analítics, dissenys experimentals i tecnologies d'aquests RDTs. Tots els mètodes desenvolupats s'han provat i optimitzat amb exosomes derivats de sobrenedants de cultiu cel·lular de les línies cel·lulars MCF-7, MDA-MB-231 i SKBR3, com a model de cèl·lules de càncer de mama. En primer lloc, es va abordar la producció, aïllament i purificació d'aquests exosomes cultivats. Les nanovesícules canceroses obtingudes es van caracteritzar física i molecularment amb mètodes analítics estàndard, com ara l'anàlisi de seguiment de nanopartícules, la microscòpia electrònica de transmissió criogènica i la citometria de flux. Un dels principals reptes per analitzar els exosomes en un RDT és augmentar la sensibilitat i millorar els límits de detecció dels assajos. En aquesta direcció, es va explorar l'ús de tècniques de preconcentració magnètica i d'amplificació d'àcids nucleics, com la RT-PCR de doble marcatge, per al seu ús en aquest tipus de mostres. En aquesta tesi es desenvolupa un nova plataforma que combina la separació immunomagnètica i la detecció electroquímica d'amplicons doblement marcats per a la detecció quantitativa dels exosomes, basat en l'amplificació de les seqüències mRNA de gliceraldehid-3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH). El mètode desenvolupat es va provar amb mostres reals de sèrum humà i permet diferenciar pacients amb càncer de mama i individus sans, millorant notablement els límits de detecció. D'altra banda, es van explorar RDTs basats en paper. Amb aquestes plataformes s'aconsegueix la simplificació dels assajos i la millora de les característiques per a entorns amb recursos limitats. En aquesta tesi s'explora per primera vegada la potencialitat de l'assaig de flux vertical (VFA) per a la detecció visual d'exosomes. Aquest mètode es basa en l'ús de la fosfatasa alcalina com a marcador enzimàtic, produint un senyal colorimètric a la superfície de les membranes de paper. Els senyals visuals es van poder quantificar amb un programari d'anàlisi d'imatges, obtenint resultats prometedors per a la caracterització de marcadors de proteïnes en exosomes amb un dispositiu senzill i de baix cost. Per últim, es van explorar altres enfocaments no convencionals per a la detecció d'exosomes, centrats en la detecció de la seva activitat enzimàtica intrínseca. Es va estudiar l'activitat intrínseca de les aldehid deshidrogenases (ALDH), també com a biomarcador sobreexpressat en càncer. Es va desenvolupar un nou mètode basat en la nano-citometria de flux per a la detecció d'aquests enzims directament dins dels exosomes. Aquest estudi representa el primer pas cap al desenvolupament d'un nou RDT dirigit a l'activitat intrínseca de l'ALDH dels exosomes.
Novel methods for the detection of exosomes as biomarkers for noncommunicable diseases
Pallarès Rusiñol, A. (Autor). 4 de nov. 2022
Tesi d’estudis: Tesi doctoral
Tesi d’estudis: Tesi doctoral