Multiplex analysis of circRNAs in lung cancer using the nCounter technology

Resum

El càncer de pulmó (CP) és un dels càncers més comunament diagnosticats i la principal causa de mort relacionada amb el càncer a tot el món, principalment degut al seu diagnòstic en estadis tardans i a la manca de tractaments efectius per a un nombre significatiu de pacients. En conseqüència, avanços en el diagnòstic precoç del CP són essencials per a poder millorar la supervivència global d’aquests pacients. Els ARN circulars (circRNA) són un tipus d’ARN amb una estructura estable i una expressió teixit específica. Diversos treballs científics indiquen com l’expressió anormal d’alguns circRNA pot exercir un paper en la carcinogènesis i la progressió del tumor. En aquest context, molts laboratoris estan investigant actualment el valor clínic dels circRNAs que es troben en les biòpsies líquides. Desafortunadament, la falta d’una metodologia estandarditzada per a l’estudi de circRNAs, a més de les limitacions inherents a les biòpsies líquides, està frenant la seva implementació clínica. El sistema nCounter de NanoString pot quantificar els nivells d’expressió de fins a 800 molècules de ARNs extretes de material fixat en formalina i inclòs en parafina (FFPE), lisats cel·lulars o biòpsies líquides. Les avantatges d’aquesta plataforma són la brevetat del seu protocol, així com la seva capacitat per a treballar amb molt poca quantitat de mostra altament degradada._x000D_ No obstant això, fins on nosaltres sabem, no hi ha evidència sobre l’ús d’aquesta plataforma per a l’estudi dels circRNAs en mostres de CP. Per això, el principal objectiu d’aquesta tesi ha estat testar la tecnologia nCounter per a l’estudi de l’expressió dels circRNAs en mostres de CP, incloent-hi línies cel·lulars, mostres FFPE i biòpsies líquides. En el capítol 2, presentem un estudi de nCounter per a la detecció de circRNA en mostres de CP. Primerament, vam dissenyar i validar en línies cel·lulars de CP un panell de circRNAs per a nCounter. Després, el panell es va utilitzar per a estudiar l’expressió de circRNAs en biòpsies de teixit. Com a resultat, trobem un grup de circRNAs diferencialment expressats en CP (n = 53), enfront de controls sense càncer (n = 16). A més, l’anàlisi d’aprenentatge automàtic (Machine Learning, ML) ens va permetre desenvolupar dues signatures de circRNA per a discriminar biòpsies de CP, d’estadis primerencs i tardans, de mostres no tumorals. En el capítol 3, vam validar un protocol per a l’anàlisi dels circRNAs continguts en les vesícules extracel·lulars (EVs) per nCounter. Posteriorment, vam utilitzar el nostre protocol per analitzar els EV-circRNAs en mostres de plasma de pacients amb CP (n = 36) i controls sense càncer (n = 30). Novament, vam trobar un grup d’EV-circRNAs expressats diferencialment en mostres de pacients amb càncer que podrien usar-se potencialment com biomarcadors de CP. A més, ML ens va permetre trobar una signatura de 10 circRNAs que va permetre diferenciar les mostres de CP dels controls. La purificació dels EVs és un procés que pot resultar difícil d’implementar en l’entorn clínic. En conseqüència, en el capítol 4, vam analitzar nCounter en mostres d’RNA extretes directament de plasma, detectant una major quantitat de circRNAs en aquestes mostres en comparació amb aquelles enriquides en EV. Després, vam analitzar mostres de plasma de pacients amb CP en estadi primerenc (n=49) i de controls sense càncer (n=49), els quals incloïen també individus amb nòduls benignes (n=19/49). Posteriorment, a través de ML, vam poder generar una signatura per discriminar el CP en etapa primerenca amb un àrea sota la corba (AUC) ROC de 0.9._x000D_ En conclusió, aquesta tesi ha demostrat que nCounter es pot utilitzar per a l’estudi de circRNAs en mostres de CP, establint les bases per al desenvolupament d’assajos de circRNA clínicament rellevants.

Data del Ajut	23 de nov. 2022
Idioma original	Anglès
Supervisor	Rafael Rosell Costa (Director/a)