Metabolic engineering of Komagataella phaffii for renewable methanol bioconversion into 3-hydroxypropionic acid

Resum

El metanol està emergint com una matèria primera d'interès creixent per a la producció de compostos químics d'alt valor a partir de microorganismes, gràcies al seu origen potencialment renovable (per exemple, a partir de CO2) i els avantatges econòmics i ambientals que ofereix. En aquest context, el llevat metilòtrof Komagataella phaffii (també conegut com Pichia pastoris) destaca com una factoria cel·lular prometedora per a la indústria química basada en metanol. K. phaffii no només és capaç d'assimilar metanol, sinó que també presenta altres avantatges metabòlics i industrials, com la compartimentació de rutes sintètiques gràcies a la presència d'orgànuls (peroxisomes, mitocòndries) i la seva tolerància natural a condicions àcides, fet especialment rellevant per a la producció d'àcids carboxílics. En aquesta tesi, K. phaffii ha estat modificat genèticament per produir àcid 3-hidroxipropiònic (3-HP) a partir de fonts de carboni renovables com el metanol. El 3-HP és un àcid orgànic de tres carbonis considerat un producte plataforma, atès que és precursor de l'àcid acrílic i altres compostos industrials. Tot i que ja s'ha aconseguit produir-lo biològicament en diversos microorganismes, les mètriques de producció continuen sent un repte per a la seva aplicació industrial generalitzada. L'enginyeria metabòlica, per tant, juga un paper clau per millorar aquests paràmetres. Aquesta tesi comença amb la compartimentació de la ruta metabòlica del malonil-CoA al peroxisoma, mitjançant la localització del gen mcr de Chloroflexus aurantiacus en aquest orgànul i l'aplicació d'altres estratègies d'enginyeria per augmentar la disponibilitat de precursors. Tot i això, la producció de 3-HP fou inferior a la de les soques amb producció citosòlica. La producció peroxisomal de 3-HP es va reconceptualitzar com un sistema biosensor per estudiar la disponibilitat de NADPH en aquest orgànul. A través d'aquest sistema es va poder identificar una estratègia prometedora per augmentar el NADPH peroxisomal: la coproducció del sistema llançadora Idp2/Idp3 i la NADH quinasa citosòlica cPos5 de Saccharomyces cerevisiae. Tot i les prometedores aplicacions de la ruta peroxisomal, la producció citosòlica es va establir com la millor opció per obtenir altes productivitats. A més, mitjançant simulacions amb un model metabòlic a escala genòmica de K. phaffii, la ruta de la β-alanina fou identificada com una via més eficient que la del malonil-CoA per produir 3-HP a partir de metanol. Així, es va implementar per primera vegada aquesta ruta en K. phaffii mitjançant l'expressió dels gens heteròlegs panD, yhxA i ydfG. L'optimització d'aquesta soca va permetre obtenir fins a 21. 4 g/L de 3-HP amb un rendiment de 0. 15 g/g i una productivitat volumètrica de 0. 48 g/L·h. Aquesta soca fou millorada a través de la introducció d'una variant de formiat deshidrogenasa NADP⁺-dependent per augmentar la disponibilitat de NADPH, la qual va resultar en millores en el consum de metanol i en la productivitat específica de 3-HP. A més, un segon cicle d'enginyeria metabòlica enfocat a incrementar precursors i l'exportació de 3-HP va donar lloc a la soca amb millors rendiments. El seu cultiu en discontinu alimentat (fed-batch) augmentà un 42% la concentració de 3-HP i un 22% la productivitat volumètrica en comparació a la soca de referència. A més, els cultius a pH 3. 5 van demostrar el paper dels transportadors d'àcids monocarboxílics en la tolerància al 3-HP en condicions àcides. En conjunt, aquesta tesi demostra el potencial de K. phaffii per a la producció sostenible de 3-HP a partir de metanol, assolint la productivitat volumètrica més alta reportada fins ara en aquest context.

Data del Ajut	26 de juny 2025
Idioma original	Anglès
Supervisor	Pau Ferrer Alegre (Director/a) & Joan Albiol Sala (Director/a)