L’ús cada cop més extensiu de plataformes “òmiques” per a l’estudi de llevats ha generat grans quantitats d’informació relativa a la fisiologia cel·lular sota diferents condicions de cultiu, la qual pot ser utilitzada per al desenvolupament de noves estratègies d’enginyeria genètica. S’ha observat que els nivells d’expressió d’un fragment d’anticòs humà produït en el llevat metilotròfic Pichia pastoris augmenten significativament quan aquest és cultivat en nivells de baixa disponibilitat d’oxigen. Anàlisis transcriptòmics mostren que hi ha una regulació important dels gens involucrats en el metabolisme de lípids i la resposta al mal plegament de proteïnes (UPR), destacant la l’augment de transcrits provinents de gens involucrats en les rutes de biosíntesi de l’ergosterol i esfingolípids. A més, s’ha observat que la presència en el medi de cultiu de fluconazol, un agent antifúngic que inhibeix específicament l’activitat de la esterol C14α-demetilasa (Erg11p) en la ruta de biosíntesi de l’ergosterol, resulta en una disminució dels nivells d’ergosterol en les membranes cel·lulars, millorant els nivells de proteïna recombinant secretada al medi de cultiu. Finalment, el factor de transcripció Hac1, amb un paper important en la regulació de la UPR, també es troba involucrat en la regulació de la síntesi de lípids. En el present estudi, la soca de referència, P. pastoris que produeix el fragment d’anticòs 2F5 de manera recombinant, s’ha modificat genèticament per tal de canviar la seva composició lipídica. S’ha generat una bateria de soques que presenten alguns gens de la ruta de biosíntesi d’esfingolípids delecionats (DES1, SUR2), o bé sobreexpressats (DES1). Al mateix temps, s’ha alterat la ruta de síntesi de l’ergosterol de la soca de referència mitjançant la sobreexpressió del gen ERG11 o tractant les cèl·lules amb fluconazol. Finalment, també es va sobreexpressar HAC1. Les cèl·lules es van cultivar en cultius en continu sota condicions d’oxigen normals (normoxia), i baixos (hipòxia), i les soques van ser caracteritzades en quant a nivells de Fab produïts, la seva distribució intra/extracel·lular, morfologia a partir d’estudis de microscòpia electrònica (TEM), i el seu contingut lipídic, quantificant els nivells d’àcids grassos, fosfolípids, esterols, lípids neutres i esfingolípids. Amb tota aquesta informació es pretén comprendre com les cèl·lules s’adapten a canvis genètics i ambientals a través de canvis en el seu contingut lipídic. Els resultats obtinguts s’han combinat amb informació transcriptòmica prèviament publicada, demostrant que existeix una important remodelació del metabolisme lipídic quan les cèl·lules es troben en condicions d’hipòxia.
Lipidomics studies of recombinant Pichia pastoris for improved recombinant protein secretion through cell engineering
Adelantado Vallvé, N. (Autor). 5 de febr. 2016
Tesi d’estudis: Tesi doctoral
Tesi d’estudis: Tesi doctoral