Insights into the functional role of Cytosolic Carboxypeptidases 1 and 6: from interactomics to cell biology

Resum

S'hipotetitza que les proteases regulen gairebé totes les funcions biològiques, ja que representen un percentatge considerable del genoma humà. No obstant, poc se sap sobre les funcions biològiques de moltes. Això és especialment cert en el cas de les carboxipeptidases citosòliques, de les quals s'han suggerit funcions i implicacions, però sovint se'n desconeixen les veritables activitats biològiques i la implicació en processos cel·lulars complexos. Aquest treball de tesi doctoral tracta sobre la caracterització funcional de les carboxipeptidases citosòliques 1 i 6, dos enzims desglutamiladors membres de la subfamília M14D de metal·locarboxipeptidases que s'han relacionat amb processos cel·lulars rellevants com ara neurodegeneració i ciliopaties. Així doncs, la nostra recerca s'ha centrat específicament a determinar el paper funcional de les CCPs sota un punt de vista biomèdic, tractant de sorgir nous coneixements sobre la seva implicació en la salut i la malaltia. Amb aquest objectiu s’han realitzat estudis de biologia cel·lular, generació de knock out mitjançant CRISPR/Cas9, obtenció d’imatges d’alta resolució i avaluació de l’activitat enzimàtica. A més, s'ha desenvolupat i aplicat una tècnica proteòmica per a l'estudi del paisatge interactòmic d'aquestes carboxipeptidases. Aquest treball de tesi es compon de tres capítols interconnectats en què es caracteritzen funcionalment les carboxipeptidases citosòliques 1 i 6. En el primer capítol ens hem proposat la caracterització general de la CCP1 humana, el membre més gran de la família CCP, sent el que té el nombre més gran de dominis predits. L'elucidació dels papers funcionals específics a cada orgànul ha estat durant molt de temps un factor que ha contribuït significativament a l'estudi de les CCP. Per això, En aquest capítol ens hem centrat en com les cèl·lules es veuen afectades per la pèrdua d'activitat de CCP1. S'han determinat les consideracions generals de CCP1 quant al paper funcional utilitzant el knock out del gen, centrant-nos en les seves implicacions en els processos generals de desglutaminació, descrivint-ne la localització subcel·lular i el paper funcional nuclear específic. El segon capítol està destinat a la identificació dels paisatges interactòmics de CCP1 i CCP6 en humans sota un punt de vista biomèdic. Desvelar les interaccions proteïna-proteïna pot revelar com estan implicades en diferents processos, proporcionant pistes o ajudant a determinar la seva implicació en malalties. En aquest capítol s'han generat els paisatges interactòmics de CCP1 i CCP6 a partir de cèl·lules humanes in vitro, identificant nous interactors i substrats potencials que ens han permès conèixer el seu paper funcional. El treball proteòmic realitzat en aquest capítol es va dur a terme al Grup Bioscope (Universidade Nova de Lisboa, Portugal) dirigit pel professor José Luis Capelo sota la vigilància del Dr. Hugo Santos. En el darrer capítol ens vam proposar caracteritzar el ‘domini N’ conservat de les carboxipeptidases citosòliques, centrant-nos en CCP6 com a unitat mínima d'expressió de CCP. Aquest domini característic es conserva al llarg de la línia evolutiva, estant present a totes les CCPs identificades, però no en altres metal·locarboxipeptidases. Encara que s'ha realitzat un extens treball per descriure el domini catalític conservat, se sap poc sobre el ‘domini N’ i la seva implicació en l'activitat de les CCPs. Actualment, l'única informació relativa al ‘domini N’ s'ha obtingut de Caenorhabditis elegans. En aquest capítol, hem avaluat els efectes d’una mutació puntual en aquest domini sobre l’activitat enzimàtica de la CCP6 humana, alhora que avaluem les seves implicacions en l’estabilitat de la proteïna, la localització subcel·lular i l’especificitat de substrat. El treball experimental d'aquest capítol es va fer en col·laboració amb la Paula Alfonso.

Data del Ajut	10 de febr. 2022
Idioma original	Anglès
Supervisor	Julia Lorenzo Rivera (Director/a)