Identification and characterization of candidate genes for peach fruit shape

Resum

El fruit del préssec deriva de l'ovari madur, que es converteix en drupa. La seva forma pot variar entre rodona i plana, adquirint algunes formes intermèdies com la forma aplanada. En el préssec, el fruit pla (anomenat paraguaià) és causat per un al·lel parcialment dominant que ha d'estar en heterocigosis (Ss), mentre que els fruits d'arbres homozigots (SS) avorten poques setmanes després del quallat del fruit. Investigacions anteriors han identificat un marcador SSR (UDP98-412) altament associat al caràcter i que és adequat per a la seva utilització en selecció assistida per marcadors (SAM). Posteriorment, una anàlisi d'associació va revelar la possible implicació d'una quinasa del tipus Leucine Reach Repeat Receptore Like Kinase (LRR-RLK) en la determinació de la forma del fruit. En concret, una deleció de ~ 10Kb que afecta el promotor i part de la regió codificant d'aquest gen co-segrega amb la forma plana. Aquí, el nostre objectiu era clonar i estudiar en detall aquest gen (Prupe.6G281100) per dilucidar la seva funció en la determinació de la forma del fruit. Aquest gen és ortòleg al gen BAK1 (BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE 1). Una anàlisi d'alineament (BLAST) entre proteïnes va identificar homologia significativa amb gens involucrats en diferents processos biològics. El millor alineament es va produir amb el gen AtRLP12, que pot complementar funcionalment CLAVATA2, un regulador clau que controla la mida de la població de cèl·lules del meristema. L'anàlisi per RT-PCR va revelar l'absència de transcripció de l'al·lel parcialment delecionat, associat amb el fenotip pla. Les dades donen suport a Prupe.6G281100 com un gen candidat per a la forma plana en préssec. El genotipat posterior d'un panell més gran de varietats ha identificat tres varietats que escapen a l'associació entre el genotip a Prupe.6G281100 i el fenotip. Les seqüències genòmiques completes d'aquestes tres varietats van revelar variabilitat addicional en altres dos de gens LRR-RLK situats en clúster, juntament amb Prupe.6G281100, al locus S. Gran fracció d'aquesta variabilitat estava acumulada en un d'aquests dos gens (Prupe.6G281500 localitzat a 21.3 Kb de Prupe.6G281100). Aquesta variabilitat, en fase amb la deleció de 10 kb, es va observar en totes les varietats planes. El segon gen amb variabilitat addicional va ser Prupe.6G281400 (a 15.3 Kb de Prupe.6G281100) amb una seqüència de 6.1 Kb eliminada en fase amb l'al·lel S i única per a les varietats amb fenotip discordant. D'acord amb la predicció funcional, els dos gens LRR-RLK tenen la millor homologia amb NUMERO D'ORGANO FLORAL1 (FON1) i amb DWARF1 DE GROSSA TASCA (TD1). A la bibliografia es descriu que aquests gens estan involucrats en el desenvolupament dels meristemes florals i el creixement dels òrgans durant la inflorescència i el desenvolupament de les flors, inclosa l'organització estructural, l'alteració de la forma i la regulació de la mida en diverses espècies. A partir de les nostres dades, formulem aquí una hipòtesi de model de tres al·lels basada en la conformació d'al·lels en els tres gens, que poden estar involucrats, amb diferents nivells de dominància, en la determinació de la forma del fruit. En aquesta tesi també hem analitzat un mutant somàtic amb fruit rodó "UFO-4Mut" derivat de la varietat plana "UFO-4". Les dades genotípics van revelar que aquesta mutació es va produir en cèl·lules de la capa meristemàtica LII. Iniciem l'estudi d'aquests dos cultivars amb l'objectiu principal de validar el paper de Prupe.6G28000 en la determinació de la forma del fruit. No obstant això, la resecuenciación dels dos genomes va revelar una gran regió (6.5Mb) amb pèrdua d'heterozigositat (LOH) en la mostra mutant. La nostra hipòtesi és que la LOH pot haver estat produïda per la reparació d'un trencament de doble cadena (DSB) ocorreguda en el cromosoma que porta l'al·lel que causa el fenotip pla, amb el cromosoma homòleg (que porta l'al·lel per al fruit rodó). Per tant, l'al·lel que produeix una forma plana s'ha eliminat en el mutant i reemplaçat pel que produeix la forma rodona, el que explica completament la reversió del fenotip. En aquesta tesi també vam iniciar el desenvolupament dels protocols per a dues tècniques diferents. Una d'elles té com a objectiu la visualització de reordenaments cromosòmics en cèl·lules somàtiques per FISH. L'altre consisteix en l'ús de vectors virals per induir l'expressió de gens en préssec. Hem establert els primers passos en l'establiment d'aquests protocols, els quals es discuteixen en aquest manuscrit de tesi.

Data del Ajut	28 de nov. 2018
Idioma original	Anglès
Supervisor	Maria José Aranzana (Director/a)