Hepatoencefalopatia deguda a mutacions en GFM1: obtenció d’un model de ratolí modificat genèticament i estudi preclínic de teràpia gènica amb vectors adenoassociats

Resum

L’hepatoencefalopatia deguda a mutacions en GFM1, també coneguda com a deficiència combinada de la fosforilació oxidativa de tipus 1 (COXPD1), és una malaltia mitocondrial recessiva causada per mutacions al gen nuclear que codifica el factor d’elongació de la traducció mitocondrial G1 (EFG1). Els pacients solen manifestar una greu encefalopatia lligada sovint a insuficiència hepàtica, d’aparició neonatal i progressió ràpida, que normalment desencadena la mort durant les primeres setmanes o anys de vida._x000D_ Fins ara, l’estudi de la COXPD1 s’ha dut a terme principalment sobre models in vitro i la manca d’un model animal apropiat ha representat una limitació important per tal d’aprofundir en la fisiopatologia de la malaltia i testar potencials aproximacions terapèutiques._x000D_ En aquest treball s’han generat dos al·lels mutants per a el gen Gfm1 murí: un al·lel knock-in (KI) amb la mutació antisentit p.R671C, identificada en almenys 10 pacients que han sobreviscut més d’un any, i un al·lel knock-out (KO). Aquests han permès obtenir el model de ratolí homozigot KI (Gfm1R671C/R671C) i l’heterozigot compost KI/KO (Gfm1R671C/-)._x000D_ La mutació KO en homozigosi va resultar letal durant el desenvolupament embrionari, mentre que els ratolins Gfm1R671C/R671C van ser viables i mostraren un creixement normal. La mutació p.R671C va comportar una reducció dràstica de la quantitat de proteïna EFG1 mitocondrial a tots els teixits estudiats, causant als ratolins Gfm1R671C/R671C una reducció de la traducció mitocondrial i de l’activitat del complex IV (CIV) de la cadena respiratòria (RC) en fetge a les 6 setmanes d’edat. L’afectació de la traducció mitocondrial es va mantenir a les 50 setmanes d’edat, però va deixar d’observar-se l’afectació del CIV. _x000D_ El model Gfm1R671C/-, amb supervivència normal almenys fins les 80 setmanes d’edat, va manifestar una reducció d’EFG1 més pronunciada en mitocondris de fetge i cervell en comparació amb els ratolins Gfm1R671C/R671C. En conseqüència, els animals Gfm1R671C/- de 8 i 30 setmanes d’edat van experimentar una disminució significativa de la traducció mitocondrial als dos teixits diana que, al seu torn, va donar lloc a una disfunció clara del sistema OXPHOS: nivells inferiors dels complexos CI i CIV acoblats, amb la reducció subsegüent de les seues activitats enzimàtiques. Malgrat això, als ratolins Gfm1R671C/- no es va detectar cap alteració patològica a nivell hepàtic o neuromuscular associada al fenotip COXPD molecular. _x000D_ D’altra banda, actualment no existeix una cura per a la COPXD1 i la teràpia gènica es situa com a una possible estratègia apropiada per al seu tractament. Al segon bloc de la tesi es va iniciar un estudi preclínic de teràpia gènica utilitzant vectors adenoassociats (rAAV) per introduir una còpia correcta del gen GFM1 humà als ratolins Gfm1R671C/-. Una única injecció intravenosa d’un vector AAV9 amb la seqüència codificant de GFM1 sota el control del promotor de l’alfa-1-antitripsina humana, d’expressió hepàtica, (ssAAV9-hAAT-GFM1) en ratolins Gfm1R671C/- de 6 setmanes d’edat (5E+12 gv/kg), va donar lloc a una recuperació parcial de la quantitat d’EFG1 mitocondrial al fetge a les 4 setmanes del tractament. Addicionalment, va restituir els nivells dels complexos CI i CIV acoblats i de les seues activitats enzimàtiques al teixit diana, demostrant la funcionalitat de l’EFG1 codificada pel gen terapèutic. _x000D_ Per tant, a partir del treball realitzat en aquesta tesi s’ha obtingut el ratolí Gfm1R671C/- amb un clar fenotip molecular disfuncional que el situa com a un bon model animal de la COXPD1. A més a més, es mostra com l’ús de rAAV per proveir de la versió correcta del gen GFM1 aconsegueix recuperar la funció d’EFG1 de forma eficaç, apuntant a la teràpia gènica com una estratègia factible i prometedora per al tractament de la COXPD1.

Data del Ajut	21 de jul. 2023
Idioma original	Català
Supervisor	Ramon Antoni Martí Seves (Director/a) & Javier Torres Torronteras (Director/a)