El primer que es va abordar en la present Tesi Doctoral va ser la determinació de l'estructura primària completa de l'alcohol deshidrogenasa humana de la classe IV, de la qual només se'n coneixien alguns fragments parcials obtinguts per anàlisi de pèptids, en col.laboració amb el grup del Prof. Hans Jörnvall, del Karolinska Institutet d'Estocolm. Es va optar, doncs, per la clonació del seu cDNA mitjançant el triatge d'una biblioteca, utilitzant com a sonda un fragment del cDNA de l'ADH4 de rata. Posteriorment, es va procedir a l'estudi de la rellevància funcional de la posició 294, que presenta una valina en la forma humana i una alanina en la de rata. Aquesta posició està situada en la regió intermèdia de la cavitat d'unió del substrat. Així, es va fer un treball paral.lel de mutagènesi dirigida d'aquest aminoàcid, realitzant substitucions recíproques en els dos enzims. En la present Tesi Doctoral, es va expressar en E. coli i es va obtenir el mutant Ala294Val. Es van caracteritzar l'enzim recombinant i el mutant amb etanol i retinoides. També es va desenvolupar un model molecular de l'estructura tridimensional de l'enzim ADH4 de rata i es van fer simulacions de la interacció de retinoides amb els dos enzims, mitjançant estudis de docking. D'altra banda, en el nostre grup es va identificar una forma present en la mucosa digestiva de l'amfibi Rana perezi, que mostrava analogies estructurals i funcionals amb els enzims ADH4 de mamífer. La determinació parcial de la seva seqüència d'aminoàcids va suggerir que aquesta forma d'alcohol deshidrogenasa era dependent de NADP(H) en lloc de NAD(H), degut a la substitució de l'aspàrtic 223 per glicina. Els estudis cinètics subsegüents van confirmar una especificitat de coenzim fins aleshores inèdita entre les alcohol deshidrogenases de vertebrat. Per a obtenir l'estructura primària completa d'aquest enzim es va procedir a la clonació del seu cDNA, utilitzant la PCR i estratègies d'amplificació dels extrems de cDNA. Prosseguint amb la determinació de la presència en altres espècies de formes d'ADH, es va estudiar el pollastre, com a espècie model de les aus. Es va identificar un enzim amb activitat alcohol deshidrogenasa i amb preferència per NADP(H), que s'expressava en el tracte digestiu superior i en ull. L'enzim responsable d'aquesta activitat va resultar ser una aldo_ceto reductasa, que presentava la peculiaritat de ser activa amb etanol i amb retinoides, un fet fins aquell moment mai observat en aquesta família. Es va clonar el cDNA de l'aldo_ceto reductasa i es va obtenir la seva seqüència completa. Es va estudiar el patró d'expressió del gen per transferència Northern. Es van obtenir les constants cinètiques de l'enzim amb diversos substrats, incloent retinoides. Per a estudiar la base estructural de les propietats de l'enzim, es va desenvolupar un model molecular i es van realitzar simulacions de docking.
Estudis estructurals i funcionals d'oxidoreductases actives amb retinoides i etanol
Crosas Navarro, B. (Autor). 27 de juny 2001
Tesi d’estudis: Tesi doctoral
Tesi d’estudis: Tesi doctoral