Estratègies genètiques per a la inhibició de l'apoptosi en cultius in vitro d'hibridomes.

Resum

En l'actualitat, la indústria farmacèutica utilitza la tecnologia basada en el cultiu in vitro de cèl·lules animals per a la producció de compostos d'elevat interès terapèutic i també, com a model biològic per assajar l'activitat de nous fàrmacs. Moltes empreses fan ús d'aquesta tecnologia ja que es tracta del sistema biològic més apropiat per obtenir proteïnes complexes. Tot i així, pel que fa l'ús de cèl·lules animals, existeixen una sèrie de limitacions importants, ja que s'ha comprovat que una gran part de les cèl·lules presents en aquests cultius moren per apoptosi. La principal causa d'aquest tipus de mort és l'esgotament de determinats nutrients essencials o factors de creixement i l'acumulació de metabòlits tòxics per a la cèl·lula. L'apoptosi representa un greu inconvenient a nivell del cultiu in vitro en bioreactors, ja que disminueix dràsticament la viabilitat del cultiu i en conseqüència, la productivitat del bioreactor. En el present treball, s'han utilitzat les eines que proporciona la biologia molecular per tal de modificar les cèl·lules, fent-les més resistents al procés d'apoptosi. L'objectiu final és aconseguir cèl·lules que mantinguin la viabilitat durant més temps, tot i que en el medi de cultiu es donin senyals per iniciar l'apoptosi. D'aquesta manera es milloraria la productivitat i l'eficiència d'aquests processos. En aquesta tesi doctoral s'han proposat dues estratègies d'inhibició genètiques, una que consisteix en inhibir l'actuació de les Caspases, proteïnes claus en el procés d'apoptosi, i l'altra que es centra a nivell del mitocondri, punt on conflueixen els diferents senyals apoptòtics d'origen intracel·lular. Entre els diferents gens assajats, els resultats més positius s'han obtingut amb la proteïna BHRF-1. En canvi, l'expressió de la proteïna P35 no ha permès protegir les cèl·lules enfront l'apoptosi. Gràcies a l'expressió del gen bhrf-1 és possible retardar la mort per apoptosi dels cultius cel·lulars, augmentant així la productivitat del procés, i garantir la supervivència de les cèl·lules sotmeses durant 72 hores a condicions inductores de l'apoptosi, ja sigui per raons accidentals o per situacions de limitació de nutrients o acumulació de metabòlits tòxics. També s'ha observat que després d'un cert període de manteniment de la resembra, les cèl·lules transfectades perden la capacitat de protegir-se contra l'apoptosi, ja que l'expressió del gen antiapoptòtic s'acaba silenciant. Per aquest motiu, es necessari l'ús de vectors que expressin el gen d'interès al llarg del temps. Els resultats obtinguts han demostrat que els vectors bicistrònics són una bona eina per modificar genèticament les cèl·lules animals ja que per una banda, permetent una integració adequada del fragment de DNA clonat i per l'altra que les modificacions genètiques realitzades perdurin al llarg de temps sense la necessitat d'exercir una selecció constant amb antibiòtic, aspecte molt important sobretot quan s'opera en bioreactors durant períodes molt llarg de temps i es treballa amb volums propis d'un bioreactor. En els cultius en perfusió s'ha vist que l'expressió del gen antiapoptòtic bhrf-1 permet reduir considerablement el nombre de cèl·lules mortes en el cultiu, tot mantenint la densitat de cèl·lules viables. Aquest fet és molt important, ja que es pot allargar la durada del cultiu i en conseqüència, augmentar els nivells de producció del procés. També s'ha observat que aquesta disminució de cèl·lules mortes coincideix amb un alentiment del cicle cel·lular dels hibridomes, suggerint que probablement la proteïna BHRF-1 actua directament sobre el cicle cel·lular i no sobre la via mitocondrial, ja que semblaria que, en condicions anòmales (limitació de nutrients), afavoreix l'entrada de les cèl·lules a l'estat de quiescència (fase G0), la qual cosa impediria l'activació de l'apoptosi.

Data del Ajut	26 de març 2007
Idioma original	No s'ha definit/desconegut
Supervisor	Jordi Joan Cairó Badillo (Director/a) & Joaquim Vives Armengol (Codirector/a)