Eficàcia i seguretat gènica dels desoxiribonucleòsids com a tractament dels trastorns del manteniment de l’ADN mitocondrial

Resum

Les síndromes de depleció i delecions múltiples de l'ADN mitocondrial (ADNmt) (MDDS) són malalties caracteritzades pel manteniment incorrecte de l'ADNmt que resulta en alteracions quantitatives (depleció) i/o qualitatives (delecions múltiples i mutacions puntuals) de l'ADNmt. Aquestes síndromes són malalties minoritàries amb presentació clínica heterogènia, que inclou quadres moderats en pacients adults o presentacions molt greus en edats pediàtriques._x000D_ Les MDDS estan causades per mutacions en gens nuclears que codifiquen proteïnes que participen en el manteniment de l'ADNmt a través de diferents mecanismes: (I) a través de la maquinària de replicació de l'ADNmt, (II) a través del metabolisme dels desoxiribonucleòsids trifosfat (dNTPs), (III) a través de la regulació de la dinàmica mitocondrial o (IV) a través d'un mecanisme desconegut._x000D_ Els desoxiribonucleòsids (dNs) van ser proposats com a tractament per una de les formes de MDDS, la miopatia per dèficit de TK2 (enzim que participa en l'anabolisme dels dNTPs). Aquesta aproximació va mostrar eficàcia en models murins de la malaltia, en una cohort de pacients i, actualment, es troba en fase d'assaig clínic. Posteriorment, estudis in vitro han mostrat que els dNs també estimulen la replicació de l'ADNmt en cèl·lules amb mutacions en POLG (ADN polimerasa mitocondrial) i en MPV17 (que participa en el manteniment de l'ADNmt a través d'un mecanisme desconegut). Aquests resultats semblen indicar que el mecanisme terapèutic dels dNs implica un increment en les quantitats de dNTPs que estimula la replicació de l'ADNmt. Per aquest motiu, els dNs es podrien estendre a MDDS no causades per alteracions en el metabolisme de dNTPs._x000D_ Aquesta tesi consta de 3 blocs diferenciats. En el primer bloc s'ha avaluat l'eficàcia dels dNs per a algunes formes de MDDS in vitro i in vivo. Els estudis in vitro s'han fet administrant dNs a fibroblasts en cultiu de pacients amb mutacions en 10 gens associats a MDDS, la majoria d'ells no relacionats amb el metabolisme de dNTPs. Els resultats han revelat que els dNs estimulen la replicació de l'ADNmt en gairebé tots els casos on hi ha depleció de l'ADNmt in vitro. Per tant, el seu ús es podria estendre a MDDS no relacionades amb el metabolisme de dNTPs. Els estudis in vivo s'han fet administrant dNs a ratolins Dguok-/-, un altre gen associat a MDDS que participa en el metabolisme de dNTPs. Aquests estudis han mostrat absència d'efecte terapèutic, potser degut a la baixa biodisponibilitat dels dNs purínics i/o manca de la seva fosforilació._x000D_ Donat que les alteracions en les concentracions de dNTPs causades pels dNs són potencialment genotòxiques, en el segon bloc de la tesi s'ha estudiat la seguretat gènica del tractament analitzant la integritat i fidelitat de còpia de l'ADNmt (presència de delecions i mutacions puntuals) mitjançant PCR llarga i seqüenciació massiva. S'han analitzat mostres d'ADN obtingudes en els experiments d'eficàcia in vitro, teixits de ratolins Dguok-/- i Tk2-/- on s'havia testat l'eficàcia in vivo i sang de pacients amb dèficit de TK2 sotmesos al tractament amb dNs durant mesos o anys. En aquest darrer cas, també s'ha analitzat la mutagènesi utilitzant un panell de gens nuclears. Tots aquests estudis han mostrat absència de genotoxicitat del tractament._x000D_ Finalment, en el tercer bloc de la tesi, s'ha estudiat el rol del transportador equilibratiu de nucleòsids ENT1 sobre l'efecte terapèutic dels dNs en el context del dèficit de TK2. Aquests estudis, realitzats en ratolins Tk2-/- i Ent1-/-, han revelat que ENT1 és un mediador necessari per l'efecte terapèutic dels dNs en aquesta malaltia associat a l'entrada de dNs en el cervell dels ratolins. Aquests resultats obren la porta a modular l'activitat del transportador per millorar l'eficàcia dels dNs.

Data del Ajut	12 de jul. 2024
Idioma original	Català
Supervisor	Ramon Antoni Martí Seves (Director/a) & Yolanda Cámara Navarro (Director/a)