Development of recombinant aldolase production process in Escherichia coli

Resum

Aquest treball s'ha centrat en el desenvolupament del procés de producció d'aldolases recombinants en Escherichia coli. D'una banda, el procés de producció de fuculosa 1-fosfat aldolasa (FucA) recombinant va ser automatitzat utilitzant un sistema d'expressió basat en un promotor feble induïble per IPTG. Donat que la inducció en forma de pols no afectava de forma significativa el metabolisme cel·lular fins que s'havia assolit un alt rendiment de producte, es va implementar un control robust del procés mitjançant l'automatització d'alimentació exponencial de substrat. Es van obtenir cultius d'alta densitat cel·lular controlant la velocitat específica de creixement a nivells de substrat limitants. El llaç de control utilitzat es va basar en l'estimació indirecta de la biomassa (utilitzant l'anàlisi dels gasos de sortida) i balanços de matèria. D'altra banda, es va desenvolupar el procés de producció de ramnulosa 1-fosfat aldolasa (RhuA) recombinant utilitzant un sistema d'expressió basat en un promotor fort induïble per IPTG. Estudis preliminars d'expressió obtinguts en cultius en erlenmeyer van indicar que l'ús d'un promotor fort presentava importants avantatges. En comparació amb el sistema d'expressió basat en un promotor feble, es van obtenir alts rendiments de producte en terminis més curts i amb menors requeriments d'inductor. No obstant això, el sistema va resultar ser extremadament sensible a la inducció en cultius d'alta densitat cel·lular. Per tant, es va prestar especial atenció al desenvolupament de les estratègies de procés més adients. En primer lloc, el desenvolupament del procés es va centrar en l'aplicació estratègies d'inducció alternatives en cultius d'alta densitat cel·lular. Tot i que en els estudis preliminars d'expressió s'havien aconseguit elevades activitats específiques, es van mesurar valors inferiors en cultius d'alta densitat cel·lular induïts amb polsos d'IPTG. Les condicions que provocaven un xoc metabòlic a les cèl·lules es van identificar i evitar mitjançant l'aplicació d'una estratègia d'addició contínua d'inductor. Aquesta estratègia va permetre la modulació de la velocitat d'expressió de la proteïna, de tal manera que la durada de la fase de producció es va estendre, els requeriments d'inductor van disminuir i es van assolir elevats rendiments de producte. Tot i això, els resultats encara indicaven una menor activitat específica de l'enzim que en el cas dels estudis preliminars d'expressió. Disminucions de l'activitat enzimàtica s'han atribuït sovint a l'estrès degut a un excés de temperatura (ja sigui traduït en un mal plegament de la proteïna i/o a proteòlisi en sí), de tal manera que es va dur a terme l'optimització de la temperatura del procés. En aquestes condicions es van mesurar velocitats de producció específiques més baixes, però es va aconseguir millorar significativament els rendiments de RhuA activa. També es van dur a terme estudis preliminars de modelització del procés. Tot i que no va ser possible calibrar un model de producció prou robust com per descriure totes les situacions que podrien ocórrer (i, per tant, l'optimització matemàtica de l'estratègia del procés no seria fiable), els estudis van permetre la identificació dels aspectes més importants del procés així com dels colls d'ampolla d'aquest. Aquesta informació va permetre desenvolupar una estratègia de creixement alternativa amb l'objectiu de reduir l'estrès cel·lular degut a la limitació de substrat. Mitjançant el control dels nivells de glucosa al bioreactor, es van obtenir cultius d'alta densitat cel·lular a nivells de substrat inhibitoris per evitar l'acumulació d'acetat. Després de l'optimització de l'estratègia d'inducció, es van obtenir alts rendiments de producte així com una elevada activitat específica de l'enzim. Finalment, es va realitzar un anàlisi global del procés de producció. Donat que l'objectiu era obtenir un enzim immobilitzat per ser utilitzat com biocatalitzador, les diferents estratègies de producció van ser comparades tenint en compte el seu impacte en les etapes posteriors de purificació i immobilització. Els resultats van mostrar que les estratègies alternatives de procés que s'havien desenvolupat en aquest treball augmentaven significativament els rendiments específics de RhuA immobilitzada activa respecte a l'anterior estratègia. Aquests resultats van posar de manifest la necessitat d'optimitzar la producció de proteïnes recombinants considerant tant el procés de producció com les fases posteriors de purificació i immobilització conjuntament.

Data del Ajut	8 de maig 2009
Idioma original	No s'ha definit/desconegut
Supervisor	Josep López Santin (Director/a) & Carlos de Mas Rocabayera (Director/a)