Development of quantum dot-based tools for in vitro and biosensing applications

Resum

Aquesta tesi descriu l'ús de quantum dots (QDs) en el desenvolupament de noves eines per aplicacions biològiques. S'han utilitzat QDs comercials d'estructura core/shell de CdSe/ZnS amb propietats òptiques i electroquímiques úniques gràcies a les quals s'han desenvolupat diversos sensors òptics i electroquímics per detectar proteïnes, cèl·lules i ADN. Primerament es va descriure un protocol utilitzant QDs en immunocitoquímiques per visualitzar proteïnes intracel·lulars com la β-tubulina (proteïna de microtúbuls), la GM130 (proteïna de l'aparell de Golgi o la EEA1 (proteïna d'endosomes). L'ús de QDs va aportar una considerable estabilitat i robustesa a la tècnica, demostrant que podien ser usats rutinàriament com a marcadors òptics en immunocitoquímiques. Posteriorment es van utilitzar com a marcadors duals òptics/electroquímics per detectar cèl·lules apoptòtiques. Els QDs es van conjugar amb Annexina-V (AnnV), proteïna de reconeixement de la fosfatidilserina, que es transloca a la superfície externa de la membrana cel·lular en cèl·lules apoptòtiques. El marcador resultant va permetre l'adquisició d'imatges qualitatives utilitzant microscòpia confocal, l'obtenció d'imatges d'alta resolució utilitzant microscòpia electrònica de rastreig i la mesura quantitativa de cèl·lules apoptòtiques utilitzant citometria de flux. A més, la voltametria d'ona quadrada es va aplicar per desenvolupar un innovador biosensor electroquímic que permetia detectar cèl·lules apoptòtiques de manera ràpida, semiquantitativa i econòmica. Aquest treball va provar la versatilitat dels QDs, convertint-los en una eina única per fer estudis complets d'un estat biològic específic en cèl·lules vives, com ara l'apoptosi. Després, l'enfoc es va posar cap al desenvolupament d'un dispositiu per testar fàrmacs basat en l'ús de QDs i microfluídica utilitzant la mateixa estratègia de marcatge (QD-AnnV). Una sèrie de microcanals interconnectats es van dissenyar amb diferents geometries per dur a terme diverses funcions: el primer per preparar diferents concentracions de camptotecina (fàrmac pro-apoptòtic model), el segon per conjugar els QDs amb l'AnnV i, l'últim, per cultivar les cèl·lules i detectar l'efecte de la camptotecina en aquestes. L'ús de la microfluidica no només va fer els experiments més robustos, donat que tots els passos eren gairebé automatitzats, sinó que va fer el procés més econòmic, ja que la despesa de reactius era menor. L'exitosa detecció en chip de cèl·lules apoptòtiques va demostrar que la combinació d'eines innovadores, com els QDs i la microfluídica, pot donar lloc a una nova generació de plataformes de "punt de cura" (point of care) per testar fàrmacs. Finalment, els QDs es van utilitzar, conjugats amb estructures d'ADN en forma de forquilla anomenades Molecular beacons (MBs), per detectar àcids nucleics. Els MBs estaven modificats amb una molècula extintora de manera que, quan els QDs es conjugaven amb els MBs, la seva fluorescència s'apagava. Aquesta estratègia es va utilitzar per detectar seqüències d'ADN que, quan hibridaven amb els QD-MBs, feien obrir l'estructura de forquilla, fent recuperar la fluorescència dels QDs. A més, aquest procés es va integrar en un canal microfluídic transparent que permetia seguir en temps real tots els esdeveniments: la immobilització dels QDs al canal, la conjugació dels QDs amb els MBs i la hibridació amb l'analit a detectar. Per tant es pot concloure que, els QDs, a més de poder reemplaçar els fluoròfors orgànics, poden ser combinats amb mètodes electroquímics i altres tecnologies com la microfluídica, generant un ventall de biosensors i dispositius versàtils i alternatius.

Data del Ajut	13 de nov. 2015
Idioma original	Anglès
Supervisor	Maria del Carme Nogues Sanmiquel (Director/a) & Arben Merkoçi Hyka (Director/a)