Aquest projecte va començar a partir de la troballa fortuïta per part del grup del Dr. Joan Verdaguer (Universitat de Lleida) d'un pèptid anomenat DIF-P, derivat de la periferina, que pertany a una gran família de pèptids derivats de filaments intermedis (FI).
Aquests pèptids tenen activitat proinflamatòria i citotòxica (a concentracions majors de 50 [Mu]M) i presenten una seqüència core de 9 aminoàcids altament conservada en tots els FI. En aquest treball s'ha realitzat una caracterització exhaustiva de diverses activitats (hemolítica i antimicrobiana), a banda de les dues abans esmentades. Per obtenir una penetració i internalització cel·lular més gran a través de les membranes biològiques, als pèptids d'estudi se'ls van fer modificacions en el seu extrem carboxil-terminal, com l'addició de seqüències de 8 arginines (8R), fet que incrementa les seves activitats.
Addicionalment, s'han anat superant diverses dificultats, com la baixa solubilitat d'alguns d'aquests pèptids en medis salins, que finalment es va poder resoldre mitjançant la conjugació amb el polímer Pluronic F-127 i el seu derivat carboxilat, una molècula que polimeritza formant micel·les (m) i incorpora els pèptids catiònics, solubilitzant-los, sense que s'observi pèrdua d'activitat.
Alhora, s'ha descobert que un dels pèptids identificats, anomenat K18, ja que deriva del FI queratina 18, després de l'addició de les cues de 8R presenta una activitat hemolítica, citotòxica i antimicrobiana més gran que el pèptid inicialment descobert (DIF-P), de manera que el pèptid K18-8R és el que hem utilitzat majoritàriament en els nostres experiments.
Així mateix, s'ha aprofundit en l'activitat proinflamatòria del K18-8R(m), i s'ha vist que aquesta és òptima a concentracions de 5 [Mu]M. També s'ha comprovat que, en cèl·lules del sistema immune innat, activa l'inflamasoma NLRP3 i indueix la producció d'IL-1 beta, un procés que s'inhibeix amb inhibidors específics d'aquest inflamasoma.
D'altra banda, s'han realitzat estudis mecanístics mitjançant assaigs de microscòpia electrònica utilitzant bacteris, i s'ha observat que K18-8R(m) és capaç de produir trencaments a la membrana d'aquests. Per tal de corroborar aquest efecte, s'han dut a terme assaigs de microscòpia confocal o de fluorimetria utilitzant fluorocroms específics com Calbryte, els quals han confirmat que aquest pèptid provoca la sortida de Ca2+ intracel·lular, donant suport a la idea de que aquest pèptid provoca algun tipus de disrupció a les membranes cel·lulars, probablement a causa de la formació de porus o altres estructures.
Per acabar, s'ha descobert una nova activitat del pèptid com a agent potenciador de la transducció (PT), una línia aplicable a estratègies de teràpia gènica ex vivo. Per tal d'estudiar aquesta activitat s'han realitzat una gran quantitat d'experiments de transducció gènica utilitzant vectors lentivirals pseudotipats amb la proteïna G del virus de l'estomatitis vesicular (VSV-G) i codificant per a una proteïna fluorescent (eGFP+), tant en línies cel·lulars murines i humanes, així com en cèl·lules primàries: en progenitors hematopoètics CD34+, cèl·lules T i NK humanes.
Els resultats obtinguts amb el pèptid K18-8R(m) a concentracions d'entre 1 i 3 [Mu]M són altament prometedors, millorant la transducció fins a 8 vegades, depenent del tipus de cèl·lula diana i de les condicions experimentals utilitzades, i amb uns resultats superiors als obtinguts utilitzant el producte competidor que millor ha funcionat (LentiBoost), aprovat actualment per a ús clínic.
En definitiva, s'ha descobert un nou PT anomenat K18-8R(m) que podria millorar la eficiència i especificitat de la modificació genètica, reduint les dosis necessàries de vectors i contribuint a la durabilitat i a l'èxit per a l'avenç de la teràpia gènica ex vivo i la seva eventual aplicació a una àmplia varietat de malalties.
| Data del Ajut | 5 de febr. 2024 |
|---|
| Idioma original | Espanyol |
|---|
| Supervisor | Lluis Tort Bardolet (Director/a) & Jorge Barquinero Mañez (Director/a) |
|---|