Caracterització de l'estructura i funció del transportador de melibiosa d'escherichia coli per espectroscòpia d'infraroig

Resum

La MelB és una proteïna integral de membrana d'Escherichia coli (473 amino àcids) que transporta - o -galactòsids a l'interior de la cèl·lula, gràcies a l'energia obtinguda dels cations Na+, H+ o Li+ que cotransporta de forma simport. Cada catió competeix pel mateix lloc d'unió, essent el Na+ i el Li+ millors activadors. El model topològic d'estructura secundària acceptat actualment consta de 12 hèlixs transmembrana, amb el costat N- i C-terminal a la cara citoplasmàtica de la membrana. En aquest treball, s'ha estudiat la proteïna solubilitzada i reconstituïda en lípids d'E.coli en quatre condicions diferents de substrats: Na+, H+, Na+ i melibiosa i H+ i melibiosa.
Primerament, es va estudiar i quantificar l'estructura secundària de la MelB per espectroscòpia d'infraroig de transmissió. L'estudi revelà l'existència de dos tipus d'hèlixs alfa que sofreixen canvis conformacionals deguts a la unió a diferents substrats, essent la unió del catió Na+ el que produeix canvis majors. Aquest resultat, és coherent els canvis conformacionals a nivell dels triptòfans intrínsecs de la proteïna trobats per espectroscòpia de fluorescència. La solubilització de la MelB en detergents desnaturalitzants o bé, l'escalfament d'aquesta en detergent dodecil maltòsid, estats en que la proteïna no és funcional, provoca que els dos tipus d'hèlixs alfa es converteixen en un de sol. Això indicaria que l'existència d'aquests dos tipus d'hèlixs alfa són molt importants pel funcionament de la proteïna. La quantificació de l'estructura secundària donà un 50% d'hèlixs, 20% de làmina beta, 17% de girs reversos i un 11% assignat a hèlixs 310, llaços oberts o bé hèlixs alfa. Assignació que concorda amb el model topològic de 12 hèlixs transmembrana. La quantificació obtinguda en D2O va reforçar aquests resultats.
En segon lloc, es va aplicar la tècnica del bescanvi H/D per ATR-FTIR a la MelB, particularment útil per a estudiar les propietats dinàmiques de les proteïnes de membrana que són en general, àmpliament desconegudes. Els resultats ens mostren que la MelB és una proteïna relativament accessible, amb un bescanvi H/D a les 24h del 60%. La comparació dels nivells de bescanvi de la MelB en diferents condicions de substrats ens suggereix que l'addició de melibiosa redueix significativament l'accessibilitat al solvent aquós. Un anàlisi més profund del bescanvi H/D a nivell d'estructura secundària, revelà diferències en diferents condicions de substrats. En particular, a nivell d'estructura làmina beta i en menys grau a nivell d'estructura hèlix alfa. La unió de melibiosa confereix més protecció a ambdós tipus d'estructura. Aquesta tècnica també es va aplicar al mutant de la MelB, el R141C, en les mateixes condicions de substrats. El R141C és capaç d'unir els substrats de la MelB però no els transloca a l'altra cara de la membrana. Els resultats indiquen que el mutant unit al H+ és un 10% més accessible al solvent aquós que la MelB salvatge en la mateixa condició. L'addició de substrats també comporta canvis conformacionals, en aquest cas a nivell d'estructura làmina beta, alfa hèlix i girs reversos. L'addició de melibiosa també protegeix l'estructura làmina beta envers el bescanvi H/D, encara que en la condició Na+/melibiosa és la més protegida.
Finalment, es va aplicar la tècnica de polarització per ATR-FTIR per estudiar si la unió de diferents substrats també resultava en canvis d'orientació de les hèlixs transmembrana. Mitjançant els espectres de polarització paral·lel i perpendicular es calcula el paràmetre d'ordre, necessari pel càlcul de l'angle d'orientació. Els resultats demostren que la proteïna reconstituïda en liposomes està orientada. Les dues bandes principals corresponen a segments transmembrana helicoïdals. La MelB sense substrats (H+/MelB) mostra un angle de 26º respecte la normal a la bicapa i no sofreix cap canvi en afegir melibiosa. Tot al contrari, quan afegim Na+ a la MelB l'angle d'orientació és de 36º i la posterior addició de melibiosa el disminueix de l'ordre de 5º.

Data del Ajut	18 de jul. 2003
Idioma original	Català
Supervisor	Esteve Padrós Morell (Director/a)