Asymmetric synthesis of chiral amines using transaminases: a multienzymatic approach by pyruvate decarboxylase coupling

Resum

La present tesi es centra en el desenvolupament i optimització d’una estratègia basada en la biocatàlisi per a la síntesi d’amines quirals, les quals són compostos òpticament actius de gran valor que poden ésser utilitzats per a la síntesi de nombrosos productes, especialment en les indústries farmacèutica i agroquímica. Més concretament, es pretén sintetitzar 3-amino-1-fenilbutà (3-APB) i 1-feniletilamina (1-PEA) a través de la reacció en cascada de la transaminasa (TA) i la piruvat decarboxilasa (PDC). Aquesta cascada es basa en una síntesi asimètrica que parteix de les seves corresponents cetones proquirals i l’alanina, i és catalitzada per omega-transaminases, les quals presenten un equilibri desfavorable. Per tal de solucionar aquest problema, la PDC actua com un sistema d’eliminació de producte secundari, a través de la transformació del piruvat a acetaldehid i CO2, la qual cosa provoca un desplaçament de l’equilibri. Amb l’objectiu de superar les limitacions comercials de la PDC, la qual només es pot obtenir en petites quantitats a un cost alt, es va desenvolupar un procés sencer de producció d’aquest enzim. Es va clonar i sobreexpressar el gen de la PDC de Zymobacter palmae (ZpPDC) en Escherichia coli. Posteriorment, es va obtenir l’enzim recombinant en grans quantitats a través del desenvolupament d’un procés de cultiu d’alta densitat cel·lular en bioreactor. Pel que fa a les TAs, es disposava de quatre enzims diferents, procedents de Chromobacterium violaceum (Cvi-TA), Vibrio fluvialis (Vfl-TA) i Aspergillus terreus (Ate-TA i Ate-TA_T247S). Es va caracteritzar tant la PDC com les quatre transaminases per tal de trobar les condicions de compromís adequades per a la construcció de la cascada enzimàtica. Tenint en compte les condicions trobades, es va dur a terme, de forma preliminar, reaccions de cribratge de les quals en van sortir seleccionades la Cvi-TA i la Vfl-TA per a la síntesi de 3-APB; i Vfl-TA per a la síntesi de 1-PEA. Després de demostrar la viabilitat de la reacció en cascada de la TA i la PDC, es van aplicar diferents estratègies d’optimització per tal de maximitzar els rendiments de reacció i millorar la baixa estabilitat operacional de les transaminases. Per una banda, es van explorar algunes estratègies d’optimització de les condicions de reacció. Per l’altra, es va aplicar enginyeria del medi de reacció. Posteriorment, es va dur a terme d’immobilització dels enzims. Es van obtenir derivats immobilitzats tant de la Cvi-TA com de la Vfl-TA en suports de MANA-agarosa i epoxy-agarosa. En el cas de la PDC, es va desenvolupar un sistema innovador de purificació i immobilització simultània en MANA-agarosa. Finalment, els enzims immobilitzats obtinguts van ser aplicats en reacció i es va desenvolupar una estratègia de reacció en cicles.

Data del Ajut	22 de març 2021
Idioma original	Anglès
Supervisor	Gregorio Alvaro Campos (Tutor/a)