Aplicació del disseny de proteïnes a l'estudi de les funcions biològiques, plegament i mecanisme de catàlisi de les ribonucleasses

Els enzims que constitueixen la superfamília de les ribonucleasses gaudeixen d'unes característiques que els converteixen en candidats idònis per a l'estudi de mecanismes relacionats amb el plegament proteic i amb la catàlisi enzimàtica. A més d'això, alguns membrs d'aquesta superfamília mostren una activitat biològica que es molt interessant per a la seva possible utilització farmacològica. En aquest projecte s'intentarà profunditzar, mitjançant tècniques de mutagènesi dirigida, en el coneixement dels següents aspectes: 1) avaluació del paper jugat per diversos aminoàcids en la catàlisi i especificitat de la reacció enzimàtica. En concret l'aparició d'un nou centre catalític per modificació dels aminoàcids constituents del "subsite" p\sub 2\nosub que seran substituïts per histidina. La caracterització d'aquest nou centre implica la realització d'un control en el que es suprimeixin les histidines del centre catalític original de l'enzim nadiu. Es definiran també les correlacions amb el canvi d'especifitat (transformació d'activitat endonucleàssica en exonucleàssica) quan s'utilitzen polinucleòtids com substrats. 2) Estudis de la zona de nucleació de l'extrem C-terminal que permet el plegament de la ribonucleassa A a la seva forma nadiva; en especial es valorarà la influència del grau de hidrofobicitat de residus específics. Es comprarà el procés amb el de la ribonucleassa humana la qual conté tres prolines adicionals. Degut a que la pressència d'aquesto aminoàcids dona lloc a isomeria cis-trans i a que la transformació d'un isòmer en l'altre és un procés lent la modificació d'aquestes prolines adicionals pugui proporcionar molta informació sobre els passos limitants del plegament. 3) S'intentarà dilucidar quines parts de la mol·lècula ECP (proteina catiònica d'eosinòfils), que presenta al mateix temps activitates citotòxiques i ribonucleàssiques, són responsables d'ambdues activitats. 4)Finalment, s'estudiarà la